儀器分析技術(shù)四

儀器分析技術(shù)四第一頁，共七十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)色譜分析法

(chromatography)色譜分析法概論色譜過程和基本原理氣相色譜法高效液相色譜法毛細(xì)管區(qū)帶電泳法薄層色譜法第二頁，共七十四頁，2022年，8月28日高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)一、HPLC的特點(diǎn)二、HPLC儀的主要部件三、HPLC的主要分離類型四、HPLC分析方法第三頁，共七十四頁，2022年，8月28日一、HPLC的特點(diǎn)

高效、高壓、高速分離效率↑：固定相粒度很?。?lt;10μm）；流動(dòng)相的極性、組成可調(diào)，選擇范圍大。分析速度↑：輸液泵→高壓、高速

適用范圍廣不受被測樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于大部分有機(jī)毒物的檢測。第四頁，共七十四頁，2022年，8月28日二、HPLC儀的主要部件第五頁，共七十四頁，2022年，8月28日1.高壓輸液系統(tǒng)

包括貯液器（脫氣、過濾）和高壓泵

等度洗脫：流動(dòng)相組成不變。

梯度洗脫：按一定程序不斷改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH等，用于復(fù)雜檢材，作用與GC的程序升溫類似。第六頁，共七十四頁，2022年，8月28日2.進(jìn)樣器

流路中為高壓力工作狀態(tài)；通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。MOVIE:自動(dòng)進(jìn)樣第七頁，共七十四頁，2022年，8月28日3.色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑2～5mm，柱長10～30cm，HPLC填料粒徑3-10μm，UPLC1.7μm。MOVIE:更換色譜柱第八頁，共七十四頁，2022年，8月28日4.檢測器

常用的為紫外檢測器、熒光檢測器等。

普通紫外光度檢測器：一次只能給出被分離組分在特定波長下的吸光度信息。

光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，色譜工作站計(jì)算機(jī)快速處理，同時(shí)給出被分離組分在全波長下的紫外吸收光譜，得到吸光度-波長-時(shí)間的三維立體譜圖。第九頁，共七十四頁，2022年，8月28日5.色譜工作站

同步記錄組分的信號強(qiáng)度與保留時(shí)間的色譜流出曲線；

強(qiáng)大的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、運(yùn)算和處理功能。

第十頁，共七十四頁，2022年，8月28日三、HPLC的主要分離類型1.液-固吸附色譜以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。不同組分與吸附劑之間的“吸附與解吸附”作用大小的差異是其分離的基礎(chǔ)。當(dāng)被測組分一定時(shí)，吸附劑的吸附作用大者，則保留時(shí)間長；同時(shí)在流動(dòng)相中溶解度大者，則解吸附作用強(qiáng)，保留時(shí)間短。第十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日液-液分配色譜固定相和流動(dòng)相為兩種互不相溶的液體。不同組分在兩相間的分配作用大小的差異是其分離的基礎(chǔ)。早期通過在載體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在載體表面。在液相色譜中，流動(dòng)相和固定相的極性選擇可顯著改變組分分離狀況，因而顯得特別重要。根據(jù)化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的極性（二者極性必須有較大差距），將液-液分配色譜法又分為正相色譜法和反相色譜法。第十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日正相色譜法反相色譜法*固定相與流動(dòng)相的極性對比流動(dòng)相的極性<固定相的極性，即親水性固定液和疏水性流動(dòng)相流動(dòng)相的極性>固定相的極性，即親水性流動(dòng)相和疏水性固定液適用分離的樣品溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型化合物溶于有機(jī)溶劑的極性較小及非極性的分子型化合物組分保留和分離的一般規(guī)律極性小的組分保留時(shí)間短，先出峰極性大的組分保留時(shí)間短，先出峰色譜柱極性極性柱（又稱正相柱）非極性柱（又稱反相柱）第十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日正相色譜法反相色譜法*固定相－CN,－NH2鍵合相…十八烷基硅烷鍵合相…流動(dòng)相非極性或弱極性溶劑以水為基礎(chǔ)溶劑再加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑，甲醇－水、乙腈－水等常用對離子型化合物的分離檢測有機(jī)弱酸、弱堿及其鹽：①離子抑制法：調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸堿度，使化合物解離受抑，親脂性↑保留↑②離子對法：在流動(dòng)相中加入能與被測離子生成中性離子對的試劑，親脂性↑保留↑第十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日四、HPLC的分析方法1.定性鑒別

保留值鑒別法化學(xué)鑒別法：“離線”鑒別兩譜聯(lián)用鑒別法：LC-MS2.定量檢測

外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法第十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日3.衍生化方法

紫外-可見衍生化：①目的；②衍生化試劑熒光衍生化：①目的；②衍生化試劑第十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日4.柱切換技術(shù)

適用樣品：體內(nèi)復(fù)雜檢材（組分與內(nèi)源性雜質(zhì)不易分離）工作原理和流程：將兩根（或多根）色譜柱與檢測器組合起來，使樣品先在預(yù)處理柱上富集、凈化，并除去大量雜質(zhì)，然后進(jìn)入分析柱分離分析。

應(yīng)用廣泛：應(yīng)用該技術(shù)，樣品只需簡單預(yù)處理即可進(jìn)行分析，故其廣泛應(yīng)用于毒物分析。第十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日第十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)色譜分析法

(chromatography)色譜分析法概論色譜過程和基本原理氣相色譜法高效液相色譜法毛細(xì)管區(qū)帶電泳法薄層色譜法第十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)一、概念二、基本原理和分離過程三、應(yīng)用第二十頁，共七十四頁，2022年，8月28日一、概念和基本原理電泳：溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生定向遷移的現(xiàn)象。電泳法：利用組分的電泳現(xiàn)象建立的分離分析方法。分為平板電泳法和毛細(xì)管電泳法兩大類。廣泛用于蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、多糖等帶電分子離子的檢測。區(qū)帶電泳法：在電場的作用下，不同的離子成分在均一的緩沖液（或稱載體電解質(zhì)）系統(tǒng)中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，分離后的區(qū)帶可以用染色等方法顯示出來，也可以用光密度掃描法測定其吸光度。第二十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日

υ=μE

υ電泳遷移速度μ電泳淌度（電泳遷移率）

E電場強(qiáng)度電泳淌度（電泳遷移率）:溶質(zhì)在給定緩沖溶液中和單位電場強(qiáng)度下單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離。

CZE:

以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，在毛細(xì)管中填充緩沖溶液，在電場作用下利用兩組分電泳淌度的差異進(jìn)行分離的新型液相分離技術(shù)。第二十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日

組分（帶電粒子）的電泳遷移率與其所帶電荷呈正比，與其在體系中的摩擦阻力系數(shù)呈反比。

兩種組分被分離的條件：帶有不同的電荷或通過緩沖溶液移動(dòng)時(shí)引起的摩擦力不同。組分離子的摩擦力取決于離子的大小、形狀、遷移時(shí)介質(zhì)的黏度等因素。中性組分不能被分離。

υ=μE

υ電泳遷移速度μ電泳淌度（電泳遷移率）

E電場強(qiáng)度第二十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日二、分離過程第二十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日三、應(yīng)用第二十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)色譜分析法

(chromatography)色譜分析法概論色譜過程和基本原理氣相色譜法高效液相色譜法毛細(xì)管區(qū)帶電泳法薄層色譜法第二十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日薄層色譜法(thinlayerchromatography,TLC)一、基本原理二、操作技術(shù)三、應(yīng)用第二十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日一、TLC的基本原理1.分離過程：

將試樣點(diǎn)在薄層板的一端，并將該端浸在作為流動(dòng)相的溶劑中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。由于不同組分在兩相間吸附和解吸附作用的差異，各組分得以分離。流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。第二十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日（1）硅膠硅膠是二氧化硅（SiO2·H2O）經(jīng)特殊處理后，具有均勻孔徑和適當(dāng)比表面積的顆粒。

吸附活性位點(diǎn)：硅膠表面的硅羥基，具有較強(qiáng)的極性和微弱的酸性?；钚晕稽c(diǎn)越多，吸附力越強(qiáng)。

鈍化：硅膠吸附水分，吸附力減弱；

活化：硅膠失去水分，吸附力增強(qiáng)。活化條件：105-110℃，0.5-1h

2.固定相（吸附劑）第二十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日（2）氧化鋁為Al2O3用特殊方法處理后制備成的顆粒，具有催化活性，應(yīng)用比硅膠少。分為微酸性、中性、微堿性三種。（3）吸附劑的選擇原則①避免吸附力過強(qiáng)，否則會(huì)造成拖尾現(xiàn)象，或Rf過小。

②一般酸性吸附劑適用酸性和中性組分分離，堿性吸附劑適用堿性和中性組分的分離。酸性毒物首選硅膠板，堿性毒物首選氧化鋁板。第三十頁，共七十四頁，2022年，8月28日3.流動(dòng)相（展開劑）

由一種或多種溶劑按一定比例組成?；旌险归_劑的極性介于各單一溶劑的極性之間，并隨比例不同而有差異。第三十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日

溶劑極性由小到大的順序：石油醚<環(huán)己烷<甲苯<苯<氯仿<乙醚<醋酸乙酯<正丁醇<正丙醇<丙酮<異丙醇<乙醇<醋酸<甲醇<甲酸<水第三十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日

展開劑的選擇：三角形法第三十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日4.定性依據(jù)（1）利用組分斑點(diǎn)在展開后的薄層板中的位置和顏色鑒別

比移值Rf（retardationfactor）：

薄層色譜法的基本定性參數(shù)

Rf：0-1之間

Rf=0,1的含義？在實(shí)際操作中，Rf在之間為宜。第三十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日（2）利用原位光密度掃描圖鑒別

①用薄層光密度掃描儀將光束照射在斑點(diǎn)上，改變波長依次掃描，可得斑點(diǎn)中吸光物質(zhì)的反射吸收曲線。

②比對被測物質(zhì)與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的反射吸收曲線。第三十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日（3）洗脫后鑒別

①針對展開后難以判斷的組分斑點(diǎn)。

②先將其從吸附劑上洗脫下來，再用其他分析手段鑒別，如UV、GC/MS、HPLC/MS等。第三十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日5.定量依據(jù)：

（1）薄層掃描法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）洗脫后定量法——先洗脫再用其他定量方法第三十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日（1）薄層板制備二、薄層色譜的操作技術(shù)用吸附劑和粘合劑（羧甲基纖維素鈉CMC）制板：⑴用0.1％-0.5％CMC溶液將吸附劑調(diào)成糊狀，以適當(dāng)?shù)暮穸龋?.2～0.5mm）均勻涂于平板（玻璃）上，室溫下自然晾干；⑵使用前活化。

1.定性分析第三十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日

用點(diǎn)樣器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于3mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)展開。（2）點(diǎn)樣

手工點(diǎn)樣要求：點(diǎn)樣不能空心，多次點(diǎn)樣、干后再點(diǎn)，不要損傷薄層板面。第三十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日（3）展開上行法是最常用的展開方式。①將薄層板傾斜放入盛有展開劑的缸內(nèi)；②待展開劑蒸氣達(dá)到飽和；③將展開劑浸沒薄層板下端；④展開到規(guī)定距離后，將薄層板取出，標(biāo)記展開劑前沿位置；⑤晾干。第四十頁，共七十四頁，2022年，8月28日①熒光法：有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。②化學(xué)顯色法：噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。（4）斑點(diǎn)檢視（5）定性鑒別與定量檢測第四十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日三、應(yīng)用具體用途：

判斷兩個(gè)化合物是否相同。確定混合物中含有的組分?jǐn)?shù)。小量物質(zhì)的精制。特別注意：∵①有些有機(jī)藥毒物在空氣中久置易產(chǎn)生氧化、分解產(chǎn)物；②體內(nèi)檢材提取液中可能有被測物的代謝產(chǎn)物?！啖俦臃治鲋谐霈F(xiàn)多個(gè)斑點(diǎn)，與已知標(biāo)準(zhǔn)不便對照；

②與當(dāng)?shù)毓I(yè)對照品或代謝物作對照。第四十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)有機(jī)質(zhì)譜及兩譜聯(lián)用技術(shù)

有機(jī)質(zhì)譜法兩譜聯(lián)用技術(shù)第四十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日有機(jī)質(zhì)譜法(organicmassspectrometry,OMS)一、質(zhì)譜法的概念和基本原理二、質(zhì)譜儀三、離子峰的主要類型四、質(zhì)譜法的解析過程第四十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日一、概念和基本原理質(zhì)譜分析法應(yīng)用離子化技術(shù)，使物質(zhì)分子失去1個(gè)外層電子形成帶1個(gè)正電荷的分子離子。離子化技術(shù)提供的能量（70eV）大于分子電離能（15-20eV），分子離子中的化學(xué)鍵又繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂，形成不同質(zhì)量的碎片離子。選擇其中帶正電荷的離子使其在電場和磁場的作用下，根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z，離子質(zhì)量與電荷之比）的差異進(jìn)行分離。第四十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日++++:R1:R2:R3:R4:e+M+(M-R2)+(M-R3)+MassSpectrum(M-R1)+質(zhì)譜分析法中離子峰形成示意圖：第四十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日m/z相對離子強(qiáng)度按各離子m/z的順序及相對強(qiáng)度大小記錄的圖譜稱為質(zhì)譜圖。目前質(zhì)譜法主要是與其他技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行藥毒物性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的分析。利用質(zhì)譜圖中離子峰的位置進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析，利用離子峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。質(zhì)譜圖用條（棒）（bargraph）圖表示。坐標(biāo)正離子的m/z為橫坐標(biāo)相對離子強(qiáng)度（豐度）為縱坐標(biāo)基峰(basepeak)質(zhì)譜中的最強(qiáng)（高）峰，以其相對離子強(qiáng)度為100％,其它離子峰以基峰的相對百分?jǐn)?shù)表示第四十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日嗎啡的質(zhì)譜圖第四十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日主要部件和工作流程進(jìn)樣系統(tǒng)真空泵質(zhì)量分析器*檢測器放大器記錄器離子源m/zI二、質(zhì)譜儀第四十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日1儲(chǔ)樣器2進(jìn)樣系統(tǒng)3漏孔4離子源5加速電極6磁場7離子檢測器8接真空系統(tǒng)9前置放大器10放大器11記錄器質(zhì)譜儀

結(jié)構(gòu)圖第五十頁，共七十四頁，2022年，8月28日第五十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日高真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀需要在高真空（10-410-6Pa

）下工作：進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器離子檢測器作用：(1)大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；

(2)用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起氣體放電；

(3)引起額外的離子－分子反應(yīng)，改變裂解模型，譜圖復(fù)雜化。第五十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日作用：

使樣品中的分子氣化后電離成離子，或直接轉(zhuǎn)化成氣態(tài)離子，并使其具有一定的能量。種類：1.電子轟擊源（ElectronIonization，EI）2.化學(xué)電離源（Chemical

Ionization，CI）3.場致電離源（FI）離子源第五十三頁，共七十四頁，2022年，8月28日ElectronIonization(EI)源

應(yīng)用最廣，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖基本都是采用EI源（70eV）得到的。第五十四頁，共七十四頁，2022年，8月28日EI源：可變的離子化能量

(10~240eV)第五十五頁，共七十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量分析器作用：將離子源中形成的離子按m/z比的差異進(jìn)行分離。原理：離子在離子源中被加速→經(jīng)狹縫進(jìn)入磁場→受磁場作用作勻速圓周運(yùn)動(dòng)

第五十六頁，共七十四頁，2022年，8月28日若B和U固定不變，則離子的運(yùn)動(dòng)半徑R僅取決于離子的m/zR

離子運(yùn)動(dòng)半徑B磁場強(qiáng)度U加速電壓

磁場的質(zhì)量色散作用：不同m/z的離子有不同的運(yùn)動(dòng)半徑，磁場可將不同m/z的離子分離

當(dāng)儀器R固定時(shí)，若保持B不變，連續(xù)改變U（電壓掃描），或保持U不變，連續(xù)改變B（磁場掃描），可使離子按m/z大小順序通過狹縫到達(dá)檢測器第五十七頁，共七十四頁，2022年，8月28日離子檢測器與放大器、記錄器作用：

接收并放大微弱的離子流信號送至顯示單元和計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)樣品的質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)第五十八頁，共七十四頁，2022年，8月28日分子離子峰碎片離子峰同位素離子峰三、離子峰的主要類型第五十九頁，共七十四頁，2022年，8月28日分子離子峰概念分子電離一個(gè)電子形成的離子所產(chǎn)生的峰。用途確定化合物的相對分子質(zhì)量推斷分子式峰位（m/z值）等于化合物的相對分子質(zhì)量一般出現(xiàn)在質(zhì)譜圖的最右端，但也有例外相對強(qiáng)度取決于分子離子的化學(xué)穩(wěn)定性第六十頁，共七十四頁，2022年，8月28日穩(wěn)定性順序：芳香化合物＞共軛鏈烯＞烯烴＞脂環(huán)化合物＞直鏈烷烴＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支鏈烷烴＞醇第六十一頁，共七十四頁，2022年，8月28日思考

在相同儀器分析條件下，如果分析出芳香化合物的分子離子峰強(qiáng)度明顯弱于醇類化合物，說明什么？第六十二頁，共七十四頁，2022年，8月28日樣品不純或儀器有污染時(shí)，雜質(zhì)峰可能出現(xiàn)在最高質(zhì)荷比處。樣品分子的穩(wěn)定