食品微生物檢驗的質量控制二

食品微生物檢驗的質量控制廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心內容食品微生物檢驗質量控制概述食品微生物檢驗的室內質量控制食品微生物檢驗的室間質量控制食品微生物檢驗質量控制概述一、質量控制相關定義質量控制：滿足質量要求的操作技術和活動。質量保證：為了滿足實驗室質量要求，制定相應的計劃并實施所進行的一系列系統活動質量手冊：是描述質量系統元素的文件或文件的集合。二、食品微生物檢驗質量控制概念質量控制是食品微生物學實驗室為了保證檢驗結果實事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。三、食品微生物檢驗質量控制目的食品微生物學的質量控制是保證食源性致病菌的培養(yǎng)、分離、鑒定及血清學試驗等的準確性，避免因操作變化導致檢驗結果錯誤。四、質量控制分類分為室內質量控制和室間質量評價兩個組成部分室內質量控制：實驗室內部采取的以對比分析、跟蹤以及對實驗室工作的連續(xù)性控制計劃。室間質量評價：通過互相校準和/或檢驗對實驗室的操作和結果所進行的評價。五、質量控制內容室內質量控制

實驗室內部

質量保證的核心和基礎室間質量評價

外部組織或機構

質量評價食品微生物學檢驗

室內質量控制室內質量控制一、對檢驗人員的要求二、操作手冊三、檢測環(huán)境要求四、設備/儀器要求五、儀器設備的功能監(jiān)測六、培養(yǎng)基的質量控制七、試劑、染色液及抗血清的質控八、檢驗過程的質量控制九、標準菌株的來源和保存十、實驗室安全防護一、對檢檢驗人員員的要求求相應崗崗位的的人員員，應應具備備相應應的技技術能能力，，相應應的技技術能能力證證明（（證書書及證證件））。微生物物檢驗驗室應應有相相應技技術能能力的的人負負責室室內的的技術術工作作，并并設立立質量量監(jiān)督督員。。一、對對檢驗驗人員員的要要求高度的的主觀觀判斷斷力個人的的技能能、經經驗細菌學學的專專業(yè)水水平培訓班班實驗室室進修修學術交交流專業(yè)期期刊二、操操作手手冊各級人人員的的職責責和權權限實驗室室安全全措施施樣品采采集和和處理理指南南培養(yǎng)基基和試試劑的的配制制方法法….等等等三、檢檢測環(huán)環(huán)境要要求-房屋屋要求求房屋要要求：：足夠夠寬敞敞、通通風、、有良良好的的照明明。房屋內內墻面面及地地等應應采用用易于于清潔潔的材材料。。房間的的設置置應根根據工工作內內容加加以分分用，，設立立專用用房間間。三、檢檢測環(huán)環(huán)境要要求-環(huán)境境設施施要求求專用房房間的的溫濕濕度控控制與與記錄錄（樣樣品存存放室室）特殊環(huán)環(huán)境的的微生生物指指標控控制與與記錄錄（無無菌室室等））專用工工作室室的標標準操操作規(guī)規(guī)程和和定期期的檢檢測校校準程程序。。（潔潔凈室室等））特殊環(huán)環(huán)境中中的專專用設設施質質量控控制應應符合合有關關要求求（凈凈化工工作臺臺）三、檢檢測環(huán)環(huán)境要要求食品微微生物物學檢檢驗室室要求求布局局合理理，操操作區(qū)區(qū)域與與辦公公區(qū)域域分開開。洗洗滌室室、培培養(yǎng)室室、消消毒間間、無無菌室室應分分開。。無菌菌室要要設有有套間間或緩緩沖間間。微微生物物檢驗驗室應應備有有自動動或腳腳踩式式洗手手池和和固定定的消消毒設設施。。三、檢測環(huán)環(huán)境要求微生物檢驗驗室應制定定合理、完完善的衛(wèi)生生管理制度度，采用濕濕式保潔，，定期對操操作環(huán)境進進行消毒。。對廢棄物物，應投入入指定的容容器內，經經無害化處處理后方可可排放，，，以防某些些病原微生生物傳播。。三、檢測環(huán)環(huán)境要求需在無菌條條件下工作作的區(qū)域應應以明確標標識并能有有效地控制制、監(jiān)測和和記錄。每每天記錄環(huán)環(huán)境檢測報報告，并經經常進行空空氣落菌實實驗：定期期對無菌室室進行室內內環(huán)境消毒毒。三、檢測環(huán)環(huán)境要求-環(huán)境設施施的相關技技術指標凈化室、凈凈化工作區(qū)區(qū)域、潔凈凈環(huán)境按國國家及部頒頒標準進行行檢測。空氣潔凈度度指標：檢測頻率及及檢測方法法。一次/月；空氣氣細菌檢測測（沉降法法）。級別≥0.5μm塵粒(個/L)≥5μm塵粒(個/L)活菌顆粒平均數(cfu/平板)100≤3.5≤0.0≤1.010000≤350.0≤2.5≤3.0四、設備/儀器要求求-總則滿足開展相相關檢測項項目的要求求。制定相關設設備/儀器器的作業(yè)指指導書。設備/儀器器需進行檢檢定校準。。設備/儀器器的運行狀狀況記錄。。維修后設備備/儀器的的再校準或或檢查，應應具有完整整的檢查記記錄。溫度計實驗室必須須要有工作作溫度計和和參照溫度度計。工作溫度計計：用于日日常溫度檢檢查。參照溫度計計：用于校校正工作的的溫度計。。溫度計運行行檢查：一一般可采用用一次/半半年的運行行檢查。日常檢查、、校準檢查查、運行檢檢查等都應應做好相應應的記錄。。培養(yǎng)箱、水水浴箱和冰冰箱的溫度度控制培養(yǎng)箱的溫溫差要求，，一般顯示示值與實測測值相差不不大于±1℃，箱體體內各點溫溫差（內部部的溫度均均衡性）以以及溫度波波動同樣不不大于±1℃。溫度監(jiān)控方方法：可將將工作溫度度計置甘油油中，放入入待測箱體體內，觀察察工作溫度度計的溫度度，最好1-2次/天監(jiān)控并并記錄。高壓滅菌鍋鍋的溫度控控制（一））高壓滅菌鍋鍋；可用生生物指示菌菌法（常用用）、化學學變色紙片片及高壓滅滅菌鍋溫度度計等方法法進行檢測測。生物指示菌菌法是一種種高壓滅菌菌鍋的效果果顯示法。。高壓滅菌鍋鍋由專人操操作，并做做好作業(yè)記記錄。高壓滅菌鍋鍋使用時，，內置物品品不能太多多，單位體體積內的內內容物（每每瓶內的培培養(yǎng)基）不不能太多。。高壓滅菌鍋鍋的溫度控控制（二））高壓滅菌鍋鍋溫度波動動范圍：110，115和121±2℃。高壓滅菌鍋鍋校準周期期一般在半半年。干燥滅菌箱箱溫度控制制干燥滅菌箱箱的溫度校校準：用參參考溫度計計進行溫度度測試。干燥滅菌箱箱溫度要求求與精確度度：160±5℃℃或180±5℃℃。干燥滅菌箱箱校準周期期一般為一一年。培養(yǎng)基配制制用蒸餾水水的控制按設備說明明，定期清清潔離子交交換器和更更換離子交交換材料。。檢測要求：：西歐標準準為微生物物檢驗用蒸蒸餾水的特特定電導率率＜0.5ms/m；；細菌數＜50cfu/ml。我們日常用用的標準為為＜10ms/m。檢測頻率：：1次/每每月。蒸餾水定定點供應應，并做做好相應應的質量量控制及及記錄。。天平的管管理天平放置置要求：：無振動動、無氣氣流影響響及水平平臺面上上。天平要有有使用記記錄。天平作為為計量儀儀器是列列入國家家強制檢檢定的范范圍，一一般1次次/年進進行檢定定。容積的控控制（一一）保證高壓壓滅菌后后的稀釋釋劑滿足足標準用用量。采取稱中中法來測測定蒸發(fā)發(fā)量，體體積100ml的稀釋劑劑起重量量為101g。高壓結束束體積偏偏差不得得超過1%。采取先高高壓后定定量分裝裝，可避避免因高高壓造成成的體積積誤差。。對保存的的定量液液體應在在使用時時，注意意補充容容積。容積的控控制（二二）吸管的控控制：通通過小計計量容器器校準后后使用。。小計量容容器吸管管、容量量瓶、量量筒等玻玻璃器皿皿，校準準周期一一般為1-2次次/一年年。小計量容容器日常常使用檢檢查可每每周進行行一次，，包括容容器的完完整性，，并做好好相應的的記錄。。pH計pH計使用前前應用標標準液進進行校準準。緩沖液使使用有效效期：PH4.00約1年PH7.00約6個月月pH9.00約6個月月pH計的維護護：電極極外表的的定期清清洗；電極敏感感性檢測測及極性性恢復。。凈化工作作臺的控控制水平流凈凈化工作作臺工作作區(qū)域，，要求潔潔凈度為為100級。空空氣沉降降30min，，細菌數＜＜1個/皿。垂垂直流凈凈化工作作臺，細細菌數＜＜0.49個/皿.凈化工作作臺運行行檢查頻頻次：1次/月月，采用用細菌沉沉降檢測測。凈化工作作臺高效效過濾膜膜一般為為一年更更換一次次，并同同時進行行粒子與與細菌沉沉降檢測測。紫外線燈燈的控制制檢測方法法：儀器器測試法法和生物物測試法法。前者是通通過專用用儀器檢檢測紫外外燈管發(fā)發(fā)射的紫紫外光強強度。國國家消毒毒技術規(guī)規(guī)范中表表明在距距離照射射源1米米處，要要求其強強度為90lx。生物測試試法：采采用一定定的菌培培養(yǎng)物，，經一定定比例稀稀釋，菌菌量控制制在200-250個個/0.5ml，涂布平板板在紫外外燈光下下照射2min，，同時設置置普通光光源的對對照組，，置37℃培養(yǎng)養(yǎng)48h，計算其殺殺滅率，，要求殺殺滅率達達99%。顯微鏡的的控制顯微鏡應應有作業(yè)業(yè)指導書書，日常常維護記記錄及自自校記錄錄。顯微鏡應應置于無無振動、、避免灰灰塵、防防潮等要要求的環(huán)環(huán)境。其它微生生物檢測測專用儀儀器的控控制細菌鑒定定儀、酶酶標儀等等設備，，工作中中常用陽陽性對照照檢測其其功能的的正常性性。儀器的檢檢定則按按檢定或或自校作作業(yè)指導導書進行行。儀器的使使用登記記、校準準計劃、、校準記記錄等文文件存檔檔。儀器專人使用用，操作者應應持證上崗。。五、儀器設備備的功能監(jiān)測測高壓滅菌器：：定期監(jiān)測（（每月一次））生物指示劑：：嗜熱脂肪芽芽孢桿菌化學指示劑：：變色的指示示帶培養(yǎng)箱、冰箱箱、水浴箱：：每日早、晚兩兩次溫度觀測測，繪制溫度度曲線圖五、儀器設備備的功能監(jiān)測測厭氧培養(yǎng)裝置置：化學標記：美美藍生物學指標：：銅綠假單胞胞菌CO2培養(yǎng)箱：每天檢查箱內內的CO2含量五、儀器設備備的功能監(jiān)測測生物安全柜：：定期更換濾網網，紫外線每每3月檢查1次微生物鑒定儀儀及時更新軟件件每批號鑒定卡卡用標準菌株株測定五、儀器設備備的功能監(jiān)測測表1儀器設備的質質量控制標準準設備

控制標準

允許范圍高壓滅菌器121℃

≥121℃培養(yǎng)箱

35℃

±1℃水浴箱

37℃

±0.5℃冰箱

4℃

±2℃低溫冰箱-20℃

±5℃CO2培養(yǎng)箱5%~10%

<10%培養(yǎng)基的有效效性試驗每一批新制或或新購的培養(yǎng)養(yǎng)基，使用前前均須取標準準菌株試驗.培養(yǎng)基的試驗驗結果需要加加以記錄，項項目包括試驗驗日期、試驗驗結果以及實實驗者的簽名名等。六、培養(yǎng)基質質量控制培養(yǎng)基質量控控制培養(yǎng)基的量：：平板培養(yǎng)基的的厚度一般為為3mm(90mm平皿+15-20ml培養(yǎng)基）斜面不超過試試管的2/3常用培養(yǎng)基的的質量控制（一）檢驗項目與方方法：物理、化學學及生物學指指標鑒定A：感官測定，檢檢查其顏色與與透明度，培培養(yǎng)基應澄清清，無渾濁。。B：PH測定，按各種種培養(yǎng)基要求求的PH±0.2。C：生物學指標檢檢定，無菌實實驗、被檢培培養(yǎng)基相應細細菌生長率測測試；菌落大大小及特征的的檢測。常用培養(yǎng)基的的質量控制（一）無菌試驗：每批配好的培培養(yǎng)基須進行行無菌試驗隨機選取5%-10%的量，如果配配制大量的培培養(yǎng)基，則任任意選取10個平板或管裝裝培養(yǎng)基，35℃溫度下過夜培培養(yǎng)，證明無無菌生長為合合格常用培養(yǎng)基的的質量控制（二）生長率測試：：適用于液體和和固體培養(yǎng)基基：將菌培養(yǎng)養(yǎng)液，用生理理鹽水做倍比比稀釋，取合合適稀釋度進進行平板計數數，同時以新新鮮配制的國國標培養(yǎng)基進進行對照。常用培養(yǎng)基的的質量控制（三）菌落大小測試試：劃線分離測試試菌，取10個菌落測量量直徑大小，，其直徑均值值與新鮮配制制的國標培養(yǎng)養(yǎng)基無統計學學差異。常用培養(yǎng)基檢檢定用標準菌菌株表2常用培養(yǎng)基的的質量控制培養(yǎng)基質控菌種生長情況結果血瓊脂

巧克力瓊脂營養(yǎng)瓊脂麥康凱瓊脂

中國藍瓊脂

SS瓊脂

沙保羅瓊脂

化膿鏈球菌肺炎鏈球菌流感嗜血桿菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌福氏志賀菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌福氏志賀菌金黃色葡萄球菌產氣腸桿菌鼠傷寒沙門菌大腸埃希菌白色假絲酵母菌++++++-++-++-+明顯乙型溶血環(huán)甲型溶血環(huán)24h生長生長分解乳糖，菌落紅色不分解乳糖，菌落無色透明不生長分解乳糖，菌落藍色不分解乳糖，菌落無色不生長粉紅色菌落無色菌落，中心黑色

常用培養(yǎng)基檢檢定用標準菌菌株表2常用培養(yǎng)基的的質量控制生長生長，溶血生長部分抑制生長，黃色菌落生長，藍綠色菌落大量生長抑制生長++++++-脆弱擬桿菌產氣莢膜梭菌菌空腸彎曲菌大腸埃希菌霍亂弧菌副溶血弧菌霍亂弧菌大腸埃希菌厭氧血平板

彎曲菌瓊脂TCBS瓊脂堿性蛋白胨水

結果生長情況質控菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)基保存環(huán)環(huán)境制成的培養(yǎng)基基保存環(huán)境為為4℃冰箱，，如制成平板板則用塑料袋袋包裝置冰箱箱保存，干燥培養(yǎng)基干干粉含有活性性物質或遇熱熱易分解的物物質應仔細查查看存放條件件，多數也須須放在2-8℃條件保保存。含有高濃度膽膽鹽的培養(yǎng)基基存放于10-15℃℃。培養(yǎng)基配制的的質量控制培養(yǎng)基的制作作過程必須統統一培養(yǎng)基或添加加劑的劑量、、pH值、高溫滅菌菌的時間或溫溫度，都需遵遵照規(guī)定培養(yǎng)養(yǎng)基基名名稱稱、、本本批批配配制制量量、、配配方方、、配配制制日日期期和和配配制制人人員員姓姓名名都都必必須須詳詳細細記記錄錄培養(yǎng)養(yǎng)基基制制備備控控制制程程序序培養(yǎng)養(yǎng)基基配配制制所所用用的的儀儀器器設設備備必必須須經經過過相相應應的的鑒鑒定定。。配制制培培養(yǎng)養(yǎng)基基所所用用的的用用具具及及容容器器必必須須是是清清潔潔或或是是滅滅菌菌的的。。培養(yǎng)養(yǎng)基基的的配配制制程程序序（（一一））不同同的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基配配制制時時注注意意各各類類成成分分的的用用途途。。對于于干干燥燥培培養(yǎng)養(yǎng)基基配配制制，，同同樣樣需需要要進進行行PH測驗驗。。培養(yǎng)養(yǎng)基基的的配配制制程程序序（（二二））配制制好好的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基（（尤尤其其是是糖糖發(fā)發(fā)酵酵管管））不不宜宜久久放放。。因因為為培培養(yǎng)養(yǎng)基基吸吸收收空空氣氣中中的的二二氧氧化化碳碳，，會會使使培培養(yǎng)養(yǎng)基基變變酸酸，，從從而而影影響響細細菌菌的的生生長長。。培養(yǎng)養(yǎng)基基中中的的抑抑制制劑劑及及指指示示劑劑一一定定要要精精確確稱稱量量。。七、、試試劑劑、、染染色色液液及及抗抗血血清清的的質質控控染色色液液的的質質量量控控制制染色色液液要要標標明明配配制制或或購購入入日日期期，，選選用用適適當當的的標標準準菌菌株株作作陽陽性性及及陰陰性性對對照照鑒鑒定定。。革蘭蘭氏氏染染色色用用金金黃黃色色葡葡萄萄球球菌菌和和大大腸腸埃埃希希菌菌制制備備濃濃菌菌懸懸液液進進行行質質量量控控制制，，每每次次質質控控與與標標本本檢檢測測同同步步進進行行。。七、試試劑、、染色色液及及抗血血清的的質控控各種染染色液液的監(jiān)監(jiān)控菌菌株染色液液陽陽性性對照照菌陰陰性性對照照菌監(jiān)監(jiān)控控頻度度革蘭染染色液液金金黃色色葡萄萄球菌菌大大腸埃埃希菌菌每每天抗酸染染色液液結結核分分枝桿桿菌每每次異染顆顆粒染染色液液白白喉喉棒狀狀桿菌菌每每次莢膜染染色液液肺肺炎炎克雷雷伯菌菌每每批鞭毛染染色液液普普通通變形形桿菌菌福福氏氏志賀賀菌每每次次七、試試劑、、染色色液及及抗血血清的的質控控試劑的的質量量控制制各類試試劑，，在配配制或或購入入后均均應進進行““有效效”試試驗，，用已已知陽陽性及及陰性性菌株株進行行試驗驗試劑須須根據據標示示配制制，適適當儲儲存對較穩(wěn)穩(wěn)定的的試劑劑如靛靛基質質試劑劑應在在配制制時及及每周周予以以檢測測，凡凡不穩(wěn)穩(wěn)定的的試劑劑每天天使用用時均均應檢檢測，，合格格后才才能使使用七、試試劑、、染色色液及及抗血血清的的質控控表3常用試試劑的的陽性性、陰陰性對對照菌菌株常用試劑陽性對照菌株陰性對照菌株凝固酶試劑金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌觸酶試驗用試劑化膿鏈球菌V-P試驗用試劑陰溝腸桿菌大腸埃希菌大腸埃希菌陰溝腸桿菌氧化酶試劑銅綠假單胞菌大腸埃希菌靛基質質試劑劑金黃色色葡萄萄球菌菌七、試試劑、、染色色液及及抗血血清的的質控控診斷血血清的的質量量控制制購入的的沙門門菌屬屬、志志賀菌菌屬、、致病病性大大腸桿桿菌的的診斷斷血清清必須須立即即記錄錄其購購入日日期、、觀察察透明明度、、色彩彩有無無變化化和是是否有有沉淀淀物，，然后后置4℃冰箱保保存使用前前應注注意檢檢查診診斷血血清的的批號號、有有效期期，如如發(fā)現現渾濁濁或有有絮狀狀沉淀淀物時時，很很可能能系污污染所所致，，不能能再繼繼續(xù)使使用七、試試劑、、染色色液及及抗血血清的的質控控診斷血血清的的質量量控制制使用前前應以以陽性性及陰陰性菌菌株進進行檢檢測，，觀察察其效效價及及特異異性不得將將診斷斷血清清置室室溫保保存,各種診診斷血血清均均應置置冰箱箱中4℃保存每月用用標準準菌株株進行行一次次測定定八、檢檢驗過過程的的質量量控制制檢測質量保保證定期使用有有證標準物物質和次級級標準物質質（參考物物質）進行行內部質量量控制。參加實驗室室間的比對對或能力驗驗證利用相同或或不同方法法進行重復復檢測對留存的樣樣品進行再再檢測。重復計數要要求菌落計數精精密度控制制直接計數數，選擇同同一標本，，要求檢驗驗人員進行行菌落計數數。自身同一平平皿重復計計數誤差應應小于7.7%實驗人員之之間同一平平皿重復計計數誤差±±18.2%自身同一梯梯度平行加加樣兩皿間間相對誤差差小于7.7%實驗人員之之間同一梯梯度計數誤誤差±18.2%不同梯度間間菌落計數數最終誤差差小于7.7%菌種鑒定質質控菌種鑒定質質控要求，，對所給的的微生物菌菌種，按有有關的方法法及指標進進行生化、、血清等方方面的鑒定定。鑒定質量評評價：鑒定定程序是否否正確；鑒鑒定方法是是否正確；；具體操作作技術是否否熟練，結結果報告是是否正確。。內部質量控控制的推薦薦頻率菌落計數精精密度控制制：1次/3月；菌種鑒定控控制：1次/半半年或1年年九、標準菌菌株的來源源和保存標準菌株要要求必須是形態(tài)態(tài)、染色反反應、生理理生化及血血清學特性性典型而穩(wěn)穩(wěn)定的菌株株實驗結果重重復性好，，極少發(fā)生生變異國際社會認認可來源于專門門機構九、標準菌菌株的來源源和保存標準菌株來來源美國典型菌菌種保藏中中心ATCC衛(wèi)生部藥品品生物制品品檢定所菌菌種保藏中中心國家醫(yī)學微微生物菌種種保藏中心心九、標準菌菌株的來源源和保存標準菌株的的保存方法法冷凍干燥法法：最理想的保保存方法，，不改變菌菌種性狀，，保存時間間長手續(xù)繁瑣，，需專門的的冷凍干燥燥設備菌種保存中中心均采用用此法九、標準菌菌株的來源源和保存標準菌株的的保存方法法冰凍保存法法：此法較簡單單，將細菌菌混懸于脫脫纖維羊血血或脫脂牛牛奶中，置置液氮或-20℃冰箱保存但細菌經多多次轉種，，性狀可能能發(fā)生變異異九、標準菌菌株的來源源和保存標準菌株的的保存方法法培養(yǎng)基保存存法：最簡簡易方便的的方法，適適用于大多多數實驗室室（1）普通瓊脂脂斜面保存存法：適于于一般細菌菌的保存，，置4℃冰箱可保存存1個月。（2）血瓊脂斜斜面保存法法：適于鏈