省隊(duì)生物奧賽課件實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一：葡萄糖含量的測(cè)定——碘量法

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)此實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生掌握碘量法測(cè)定葡萄糖的基本原理掌握間接碘量法測(cè)定葡萄糖的操作方法。實(shí)驗(yàn)原理:碘與NaOH作用發(fā)生歧化反應(yīng)生成具有氧化能力的次碘酸鈉（NaIO），而葡萄糖能定量地被NaIO氧化。在酸性條件下，未與C6H12O6作用的NaIO又可轉(zhuǎn)變成I2析出，因此只要用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2，便可計(jì)算出C6H12O6的含量。其反應(yīng)過(guò)程式如下：1．I2歧化反應(yīng)：

I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2．

氧化反應(yīng)：

C6H12O6+NaIO=C6H12O7（葡萄糖酸）+NaI3．

NaIO歧化反應(yīng)：與C6H12O6作用完后，剩下的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng)：3NaIO=NaIO3+2NaI4．

酸化：NaIO3+5NaI+6HCl=3I2+6NaCl+3H2O析出的I2：I2+2Na2S2O3=Na2S4O6（連四硫酸鈉）+2NaI實(shí)驗(yàn)器材與試劑：

器材：移液管，滴定儀或滴定管，碘量瓶試劑：0.05mol.L-1碘標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.10mol.L-1Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液。2mol.L-1NaOH溶液6mol.L-1鹽酸溶液

1%淀粉待測(cè)葡萄糖溶液（約1%）碘量法是氧化還原滴定法中，應(yīng)用比較廣泛的一種方法。碘可做為氧化劑而被中強(qiáng)的還原劑（如Sn2+，H2S）等所還原．直接碘量法是供試液液就是你所測(cè)的物質(zhì)和碘反應(yīng),當(dāng)?shù)馍赃^(guò)量時(shí),淀粉和碘反應(yīng)顯藍(lán)色,這就是反應(yīng)終點(diǎn).

間接碘量法是加入定量的碘化鉀,溴試劑等,生成碘,加淀粉顯藍(lán)色,然后加入硫代硫酸鈉與碘反應(yīng),滴定終點(diǎn)為藍(lán)色消失.實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1.用移液管吸取10ml待測(cè)溶液放入碘量瓶中，準(zhǔn)確加入5mlI2標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.邊加邊搖動(dòng)的情況下慢慢加入2mol/L-1NaOH溶液至溶液呈淡黃色。3.將碘量瓶加蓋放置10—15分鐘。4.加6mol/L-1鹽酸于碘量瓶中使成為酸性。5.立即用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淡黃色。6.加入2ml淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。7.記錄滴定所消耗的Na2S2O3的量。重復(fù)試驗(yàn)一次。葡萄含量的計(jì)算：C6H12O6（g.L-1）={[（CI2VI2——1/2CNa2S2O3VNa2S2O3）

×MC6H12O6/1000]/10.00}×1000。

思考與分析：

1.碘量法測(cè)定葡萄糖的主要誤差來(lái)源有哪些，應(yīng)如何避免？2.間接碘量法為什么既可測(cè)定還原性物質(zhì)又可以測(cè)定氧化性物質(zhì)？測(cè)定時(shí)應(yīng)如何控制溶液的酸堿性？為什么？3.為什么加堿速度不能過(guò)快，如果過(guò)快則對(duì)葡萄糖的測(cè)定結(jié)果有何影響？實(shí)驗(yàn)二：總糖與還原糖測(cè)定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生掌握還原糖和總糖的測(cè)定原理，掌握用比色法測(cè)定還原糖的操作方法。實(shí)驗(yàn)原理：

本實(shí)驗(yàn)是利用3.5一二硝酸水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度成一定比例關(guān)系。通過(guò)測(cè)定540nm處的吸收值就可求出糖的含量。此法快速簡(jiǎn)便，雜質(zhì)干擾小，但糖含量超過(guò)一定范圍就會(huì)測(cè)不準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)器材及試劑：

儀器：容量瓶（100ml），漏斗，吸管，量筒，試管，燒杯，三角瓶，分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋試劑：①3.5一二硝基水楊酸（DNS）試劑（6.3gDNS和262ml2mol.L-1NaOH，加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加水定容至1000ml，貯于棕色瓶中。②1000ug/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖1.000g，加水溶解后加8ml濃鹽酸，加水定容至1000ml。③6mol.L-1鹽酸。④6mol.L-1NaOH。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：1）取5支試管按下表配制不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。管號(hào)1000ug/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖終濃度（ug/ml）1191002282003373004464005555002）另取6支試管按下表加入各種溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)

H2O100ug/200ug/300ug/400ug/500ug/DNSml

葡萄糖

mlGlcmlGlcmlGlcmlGlc10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml40.5ml0.5ml50.5ml0.5ml60.5ml0.5ml混勻后沸水浴加熱5min，取出冷卻，加入4ml水混勻，以1號(hào)管作空白調(diào)零，測(cè)定其OD540以葡萄糖含量（ug）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．淀粉中還原糖的測(cè)定：稱取淀粉1.00g放入燒杯中。用少量水調(diào)成糊狀。加50—60ml水搖勻。50℃保溫20min，使還原糖浸出。定容至100ml。過(guò)濾。取濾液0.5ml測(cè)定還原糖。方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。3．淀粉中總糖的測(cè)定：

稱取淀粉0.5g，放入三角瓶中。加入6mol.L-1鹽酸10ml，水15ml。沸水浴中加熱水解30min。冷卻后加入6mol.L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)至PH中性。水解液定容至100ml。過(guò)濾。取濾液10ml。稀釋至100ml，即為稀釋1000倍的總糖水解液。取稀釋液0.5ml測(cè)定還原糖，方法與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。將樣品中所測(cè)得的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖量，計(jì)算出淀粉中還原糖和總糖的百分含量。思考與分析：1．除此法外還有哪些方法可以測(cè)定總糖和還原糖？2．此法與其它測(cè)定糖含量的方法相比有何優(yōu)缺點(diǎn)？3．在總糖的測(cè)定中為什么不直接用水解液來(lái)測(cè)定而要稀釋后來(lái)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)三：蛋白質(zhì)含量的測(cè)定——雙縮脲法

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的其本原理，掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的操作方法。實(shí)驗(yàn)原理：兩個(gè)尿素分子在加熱的情況下失去一分子氨而形成雙縮脲分子，雙縮脲分子能與堿性硫酸銅形成粉紅色的絡(luò)合物稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中因含有多個(gè)肽鍵，因此也有雙縮脲反應(yīng)，在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，此顏色最大吸收峰波長(zhǎng)在540nm處，故可通過(guò)測(cè)定其吸收值來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法只與蛋白質(zhì)的含量有關(guān)而與蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸成分無(wú)關(guān)，但以氨基酸、Tris、肽作緩沖溶液時(shí)，反應(yīng)呈陽(yáng)性。此法快速簡(jiǎn)便，但靈敏度較差，測(cè)定范圍每毫升1—10毫克蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)器材與試劑：器材：試管，移液管，721分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋。試劑：①雙縮脲試劑：取1.5gCuSO4.5H2O和6.0g酒石酸鉀鈉用500ml水溶解后在攪拌下加入300ml10%NaOH溶液，再用水稀釋至1升。②標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：10mg/mL牛血清白蛋白溶液。③未知濃度蛋白溶液（1：100的雞蛋清稀釋液）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取12支試管分成兩組按下表分別加入試劑。試管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑（ml）444444充分搖勻后,恒溫水浴25℃保溫30min，以1號(hào)試管作對(duì)照調(diào)零測(cè)定其它試管540nm處的吸收值。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)含量作橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品的測(cè)定：取兩支試管各加入未知濃度蛋白液1ml，加入雙縮脲試劑4ml25℃保溫30min，測(cè)定540nm吸收值，通過(guò)此吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中蛋白質(zhì)的含量。思考與分析：1．蛋白質(zhì)含量的測(cè)定除雙縮脲法外，還有哪些方法，與雙縮脲法比較各有何優(yōu)缺點(diǎn)？2．有哪些因素影響其測(cè)定結(jié)果？實(shí)驗(yàn)四：維生素C的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆盏饬糠y(cè)定維生素C含量的原理。掌握維生素C含量測(cè)定的操作方法。實(shí)驗(yàn)原理：在酸性條件下，碘氧化還原型維生素C，維生素C生成氧化型，而碘被還原成無(wú)色的I-，過(guò)量的碘與淀粉生成蘭色，即為終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)試劑：2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸餾水1%草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：準(zhǔn)確稱取50.0mg純抗壞血酸，溶于1%草酸溶液，并稀釋至500ml。（貯棕色瓶，冷藏，最好臨用時(shí)配置）O.05mol/L碘液實(shí)驗(yàn)步驟：1、維生素C的提?。合磧羰卟嘶蛩⒉粮煞Q取20g蔬菜或水果加2%草酸少許研磨成糊狀用2%草酸定容100ml過(guò)濾（最初數(shù)毫升濾液棄去）濾液備用2.標(biāo)準(zhǔn)液滴定：

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1.0ml（含0.1mg抗壞血酸），置150ml錐型瓶中。加1淀粉液用碘液滴定至藍(lán)色出現(xiàn)，并保持15s不褪色即為終點(diǎn)。由所用碘的體積計(jì)算出1ml碘液相當(dāng)于多少mg抗壞血酸。3.樣品滴定取濾液20ml，加1ml淀粉液，用碘液滴定至蘭色出現(xiàn)4.計(jì)算：V×TW×100=100g樣品中含壞血酸mg數(shù)V=滴定樣品時(shí)所用去的碘ml數(shù)T=1ml碘液相當(dāng)于抗壞血酸mg數(shù)W=20ml樣液相當(dāng)于含樣品的克數(shù)1.滴定速度為什么要迅速（一般不超過(guò)2分鐘）。2.為什么最初數(shù)毫升濾液要棄去。3.有哪些因素影響測(cè)定結(jié)果。思考與分析：實(shí)驗(yàn)五：酵母RNA的提取與鑒定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1．掌握RNA的提取原理與方法。2．掌握鑒定核酸組分的方法。實(shí)驗(yàn)原理：酵母核酸中RNA的含量較高，RNA可溶于堿性溶液，而DNA不溶，用堿性溶液提取可使RNA與DNA分開，在提取液中加入酸性乙醇可使解聚的RNA沉淀而得到RNA的粗制品。

RNA含有核糖.嘌呤堿.嘧啶堿和磷酸等組分，加硫酸煮沸后可使RNA完全水解成各組分，從水解液中可以測(cè)定出各組分的存在。1．核糖的鑒定：核糖+濃鹽酸糠醛,糠醛+苔黑酚——綠色物質(zhì)。2．磷酸的鑒定：PO43-+3NH4++12MoO42-+24H+→（NH4）3PO4.12MoO3.6H2O↓+6H2O黃色磷鉬酸銨在有還原劑存在時(shí)（VitC）Mo6+被還原成Mo4+，Mo4+再與MoO42-結(jié)合成Mo(MoO4)2或Mo3O8而呈藍(lán)色即鉬藍(lán)。3．嘌呤堿的鑒定：嘌呤堿+Ag+→嘌呤銀（絮狀物沉淀）

實(shí)驗(yàn)器材及試劑：

器材：燒杯，三角瓶，試管，移液管，離心管，乳缽,量筒，水浴鍋，離心機(jī)，。試劑：酵母片0.04mol.L-1NaOH,1.5mol.L-1硫酸酸性乙醇（30ml乙醇加入0.3ml濃鹽酸）95%乙醇,濃氨水0.1mol.L-1AgNO3，苔黑酚乙醇液（6g苔黑酚溶于100ml95%乙醇）FeCl3濃HCl液（2ml10%FeCl3加入到400ml濃鹽酸中）定磷試劑：17%H2SO4：2.5%鉬酸銨：10%VitC：水=1：1：1：2（V/V）（臨用時(shí)混合）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1．RNA的提?。喝?2片酵母片，用乳缽研磨成粉末，加入30ml0.04mol.L-1NaOH溶液合并于三角瓶中，沸水浴上加熱30min。冷卻。3000rpm離心15分鐘，取出上清液，攪拌下緩慢加入10ml酸性乙醇溶液。待RNA沉淀完全后，3000rpm離心15min，棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗滌一次，沉淀備用。2．RNA的水解：將以上提取的RNA全部放入一支試管內(nèi)，加入1.5mol.L-1H2SO45ml，沸水浴中加熱10分鐘，3．組成鑒定：①嘌呤堿的鑒定：取水解液1ml，加入2ml濃氨水，然后加入1ml0.1mol.L-1AgNO3，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。②磷酸的鑒定：取1ml水解液，加入1ml定磷試劑，沸水浴加熱5分鐘，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。③核糖的鑒定：取1ml水解液加入FeCl3-濃HCl2ml和苔黑酚乙醇溶液0.5ml，沸水溶加熱10分鐘，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。思考與分析

1．在嘌呤堿鑒定中，為什么要加入過(guò)量濃氨水？2．定磷試劑中維生素C起什么作用？如果維生素C已被氧化成紅色，則對(duì)實(shí)驗(yàn)有何影響？3．此法從酵母中分離的RNA是mRNA，tRNA，rRNA還是總RNA？如果要分離出純的mRNA，下一步如何做？實(shí)驗(yàn)六：DNA的瓊脂糖凝膠電泳1．瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備：稱取0.3g瓊脂糖置于三角瓶中，加入30mLTBE緩沖液，用小燒杯反扣三角瓶口，放入微波爐中加熱（1分鐘）至瓊脂糖全部融化后取出，待凝膠溫度冷卻至60—70℃時(shí)，將凝膠倒入凝膠盒中，在膠盒一端裝上樣品槽板（即梳子），室溫放置0.5—1小時(shí)，待凝膠全部凝固，取下樣品槽板，將凝膠放入灌好電極緩沖液的電泳槽中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程2．加樣：將DNA樣品與溴酚藍(lán)指示劑按5：1（V/V）比例混合，用移液器取混合好后的DNA樣品10uL加入凝膠樣品槽中。3．電泳：將點(diǎn)樣端接負(fù)極，另一端接正極，通電調(diào)節(jié)電壓50V，電流40mA。電泳至溴酚藍(lán)距另一端1cm停止電泳。4．染色：從電泳槽中取出凝膠，放入培養(yǎng)皿或白瓷盤中，加入溴化乙錠染色液覆蓋凝膠浸泡30分鐘，取出凝膠，用水稍沖洗凝膠。5．觀察：將凝膠放在暗室（或暗處）用紫外分析儀照射凝膠，觀察凝膠中橙黃色熒光的DNA譜帶，測(cè)量每條DNA譜帶的遷移位置，求出Rf值。（注意：染色和觀察時(shí)帶手套操作，避免染色液滴灑周圍環(huán)境）。思考與分析：根據(jù)λDNA/EcoRI電泳圖譜：測(cè)量每條譜帶的遷移位置，計(jì)算出Rf值，根據(jù)Rf與lgM成反比作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（λDNA/EcoRI六個(gè)片段分別是：13.7×106，4.74×106,3.73×106,3.48×106,3.02×106,2.13×106）實(shí)驗(yàn)八：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）測(cè)定一、目的要求：（1）掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定的原理及方法。（2）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。（3）學(xué)習(xí)如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二、原理：生物機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用是—氨基酸的氨基通過(guò)酶促作用轉(zhuǎn)移到α—酮酸的酮基位置上，生成相應(yīng)的酮酸與氨基酸的化學(xué)反應(yīng)。催化這反應(yīng)的酶稱為轉(zhuǎn)氨酶（transaminase），其輔酶為磷酸吡哆醛。轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamicpyruvictransaminase,GPT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamicoxalacetictransaminase.GOT)活性較高。在正常新陳代謝過(guò)程中，血清內(nèi)維持一定水平的轉(zhuǎn)氨酶活性（即正常值）。當(dāng)肝、心、腎等組織發(fā)生病變時(shí)，由于組織細(xì)胞腫脹，壞死導(dǎo)致大量的酶釋放至血流中，從而引起血清谷丙