ELISA的基本原理和質(zhì)量控制

會計學1ELISA的基本原理和質(zhì)量控制ELISA的基本原理抗原或抗體在體外結合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學活性而能相互特異性結合。第1頁/共36頁將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體后，這種酶標抗原或抗體既能保留與相應抗體或抗原結合的免疫活性，又同時保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感性。第2頁/共36頁抗原抗體復合物與酶標的二抗結合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關系，可進行定性和定量分析。

第3頁/共36頁間接法ELISA間接法ELISA（IndirectELISA）——將特異性抗原包被于固相載體表面，與標本中相應特異性抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗人IgG或IgM抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色。第4頁/共36頁1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入二抗5.孵育6.顯色間接法ELISA第5頁/共36頁使用RF吸附劑類風濕因子（10％）是一種自身抗體，主要有IgM組成，能與抗原抗體復合物的FC段結合，非特異性IgM抗體（風濕因子）的存在將導致IgM檢測出現(xiàn)假陽性結果。第6頁/共36頁麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶標IgM抗體類風濕因子陽性結果假陽性結果第7頁/共36頁RF吸附劑的組成RF吸附劑———人IgG抗體ProteinA羊抗人IgG第8頁/共36頁

因此，在使用間接法ELISA進行IgM檢測前應用類風濕因子吸附劑對血清作預處理。第9頁/共36頁捕獲法ELISA捕獲法ELISA（CaptureELISA）——專門用來檢測IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標本中所有人IgM抗體結合，洗滌后加入特異性抗原與相應的特異性IgM抗體結合，洗滌后再加入酶標的抗原特異性抗體與之結合，洗滌后加入底物顯色。第10頁/共36頁1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色捕獲法ELISA第11頁/共36頁ELISA試劑的組成固相載體：許多物質(zhì)可以作為固相載體，如纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最為常用的是聚苯乙烯材質(zhì)的微孔板，多為8×12道96孔板條。吸附能力通透性均一性第12頁/共36頁酶標記物：酶與抗體的共價結合首先不影響酶及抗體的活性、不產(chǎn)生干擾物質(zhì)、不產(chǎn)生非特異反應。辣根過氧化物酶（HorseRadishPeroxidase，簡稱HRP）是目前應用最為廣泛的酶，是從辣根菜的根中提取。堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase，簡稱AP）是從小牛腸粘膜中提取?；钚愿?，但提取工藝復雜，價格比較昂貴。第13頁/共36頁底物：不同種類的酶要求使用不同的底物。HRP——鄰苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS

『2,2‘-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD為在ELISA中應用最多的底物，靈敏度高，比色方便，作用后變橙紅色，其缺點是配成應用液后穩(wěn)定性差。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明，加酸停止酶反應后變黃色。AP——對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。

第14頁/共36頁洗滌液：聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗滌時應非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，應嚴格按要求洗滌。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，一般是吐溫20（聚山梨酯）。洗板時注意不同試劑盒的洗液不要混用。第15頁/共36頁標本稀釋液：用來稀釋血清標本，有時也稀釋酶結合物。RF吸附劑：在進行IgM抗體檢測時，間接ELISA方法需要使用RF吸附劑去除類風濕因子的干擾作用。第16頁/共36頁ELISA的質(zhì)量控制

及注意事項

第17頁/共36頁ELISA質(zhì)量控制的目的獲得正確的檢驗結果。使不同時間和地點的ELISA檢驗結果具有可比較性。第18頁/共36頁ELISA準確度的影響因素

—患病率在檢測真正感染疾病患者中，檢測的準確度隨著該傳染病在人群中的患病率的變化而改變。患病率越高，被檢測者陽性是真陽性的可能性就越大。第19頁/共36頁患病率和陽性預測值(PPV)的關系

患病率

高低被檢測數(shù)量1000010000總陽性數(shù)100030假陽性數(shù)量2727真陽性數(shù)量9733陽性預測值（PPV）97.3%10%PPV=患病率×靈敏度/[患病率×靈敏度+(1-患病率)×(1-特異性)]×100%

第20頁/共36頁解決方法試劑1試劑2試劑1+2敏感度特異度99.0%99.0%99.5%99.9%(串聯(lián))患病率PPVPPVPPV0.2%28.4%66.4%99.75%2.0%80.2%80.2%99.97%20.0%98.0%99.6%99.99%第21頁/共36頁ELISA準確度的影響因素

—實驗過程實驗操作人員的教育背景和培訓標本的條件試驗過程中的對照試劑設備結果的解釋結果的抄寫和報告第22頁/共36頁ELISA實驗過程中涉及的質(zhì)量控制

—儀器移液器，ELISA的加樣量小，選擇量程合適的加樣槍，其準確性直接影響試驗結果。定期進行校準。水浴鍋，有外部溫度計對儀器溫度進行校準。洗板機，殘留液體不能使拍干的紙變濕，定期檢查加液孔有無堵塞。酶標儀，定期檢查。第23頁/共36頁ELISA的標本最為常見的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，用到唾液、腦脊液、尿液等標本。要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。ELISA實驗過程中涉及的質(zhì)量控制

—標本第24頁/共36頁血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。凍存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。標本在保存中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。

第25頁/共36頁標準操作規(guī)程（SOP）實驗紀錄日期操作人員試劑批號試劑有效期試劑準備，使用前在室溫平衡20min以上，以便在溫育時很快達到反應要求溫度，避免弱陽性標本產(chǎn)生假陰性結果。水浴ELISA實驗過程中涉及的質(zhì)量控制

—其它第26頁/共36頁試劑盒的陰性和陽性對照在控制范圍內(nèi)ELISA板的空白對照OD值在控制范圍內(nèi)實驗室內(nèi)部質(zhì)控血清(In-HouseControl,IHC)每次試驗都要包括一個實驗室質(zhì)控血清?？梢员O(jiān)測標本處理過程，而試劑質(zhì)控只能監(jiān)測之后的過程。確保每次試驗操作的正確性和結果的一致性。尤其是可以監(jiān)測試劑不同批號之間的差異。可以做質(zhì)控圖。ELISA實驗過程中涉及的質(zhì)量控制

—內(nèi)部質(zhì)控（IQC）包括試劑質(zhì)控和內(nèi)部質(zhì)控血清第27頁/共36頁收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血清，56℃加熱30min滅活。用0.45um濾器過濾除去污染物和雜質(zhì)，用陰性血清、正常人血清或PBS緩沖液將收集的血清進行一系列稀釋。檢測稀釋標本并繪制s形標準曲線。選擇Cutoff值1.5至3倍OD值所對應的稀釋度，作為IHC。一次準備12個月使用量，分裝到血清管，每管30ul，于-20℃保存?zhèn)溆谩?nèi)部質(zhì)控血清（IHC）的制備第28頁/共36頁如何用內(nèi)部質(zhì)控血清（IHC）做質(zhì)控圖在常規(guī)試驗條件下，將IHC放在常規(guī)樣本中，進行20次檢測，計算均值和標準差（SD）。并繪制質(zhì)控圖。2SD是一般公認的允許誤差限度。每批測定放一份質(zhì)控血清時：一次超過2SD但小于3SD作為“告警”一次超出3SD、連續(xù)二次超出2SD、3-5次連續(xù)處于一側的2SD之內(nèi)、5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側，均為失控同一批號試劑和質(zhì)控血清。第29頁/共36頁舉例：質(zhì)控圖第30頁/共36頁“即刻性”質(zhì)控只需連續(xù)測3次，即可對第3次檢驗結果進行質(zhì)控。"

即刻法"的建立具體計算方法如下：

1)先將測定值從小到大排列

2)計算X和SD。

3)計算SDI上限和SDI下限值。

4)將SDI上限、SDI下限值與SDI值中的數(shù)字比較。第31頁/共36頁當

SDI上限值和SDI下限值＜n2SD時，表示處于控制范圍內(nèi)，可以繼續(xù)往下測定，繼續(xù)重復以上各項計算；當SDI上限和SDI

下限有一值處于n2SD和n2SD值之間時，說明該值在2SD~3SD范圍，處于“告警”狀態(tài)；當SDI上限和SDI下限有一值

＞n3SD時，說明該值已在3SD范圍之外，屬“失控”。數(shù)值處于“告警”和“失控”狀態(tài)應舍去，重新測定。第32頁/共36頁Nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56SI值表

第33頁/共36頁ELISA實驗過程中涉及的質(zhì)量控制