催化水解反應的金屬酶

催化水解反應的金屬酶第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述第二節(jié)羧肽酶第三節(jié)碳酸酐酶第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日根據(jù)酶催化反應的類型，把酶分為六類：氧化還原酶類催化氧化還原反應轉移酶類催化功能基團轉移反應裂解酶類催化從底物移去一個基團而留下雙鍵的反應或其逆反應異構酶類催化異構體互相轉變合成酶類催化雙分子合成一種新物質同時使ATP分解的反應水解酶類催化水解反應第一節(jié)概述第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日一、水解酶六大酶類之中研究的最多并應用最廣泛的一類，其中有不少水解酶的活性與金屬離子有關。后頁表中列出若干水解金屬酶和金屬離子激活酶。金屬離子激活酶是指必須加入金屬離子才具有活性的酶。第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日水解酶根據(jù)水解鍵的類型不同分為六個亞類。酯酶作用于酯鍵，使其水解為酸和醇糖苷酶作用于糖基化合物，使糖鍵水解醚酶作用于醚鍵，使其水解肽酶作用于肽鍵，使其水解C-N酶作用于其它C-N鍵酸酐酶作用于酸酐本章僅對肽酶及酯酶作一些介紹

第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日肽酶催化蛋白質的肽鍵水解蛋白質為高分子物質，不能透過細胞膜，必須水解成小分子才能被腸吸收。蛋白質由各種肽酶催化，水解成小分子，被腸吸收。第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日肽酶肽鏈端解酶肽鏈內切酶（蛋白酶）氨肽酶羧肽酶嗜熱菌蛋白酶根據(jù)作用方式，肽酶又分為肽鏈端解酶和肽鏈內切酶。肽鏈端解酶從肽鏈羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者稱羧肽酶，后者稱氨肽酶。內切酶是另一類肽酶，用于切斷蛋白質分子內部肽鍵使之變成小分子多肽，如嗜熱菌蛋白酶。

第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日酯酶催化酯鍵水解，其中羧酸酯酶催化羧酸酯水解RCOO—R’+H2O→RCOOH+R’OH磷酸酯酶催化磷酸酯鍵水解

OO‖

‖RO―P―OR’+H2O→RO―P―OH+R’OH

|

|OH

OHR=H時，磷酸單酯酶（如：堿性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶C)第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日水解金屬酶之中很多都與Zn2+有關。其次：Ca2+、Mg2+，還有少數(shù)酶含Mn2+

由于水解過程不發(fā)生電子轉移，所以金屬離子的氧化態(tài)在催化過程中不變化。第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日二、水解金屬酶研究中的過渡金屬離子EPR、M?ssbauer、d-d電子光譜－金屬酶存在某種過渡金屬。Zn2+,Ca2+,Mg2+等離子不具有未充滿的d軌道，因此含有Zn2+,Ca2+,Mg2+等離子的金屬酶就難以應用上述檢測技術獲得有用信息。為了深入研究金屬酶的性質，通常采用探針。一般采用Co2+代替Zn2+，用Mn2+代替Mg2+。非過渡金屬Tl+作為K+的NMR探針。第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日使用探針離子遵循的原則：同晶置換，即探針離子在酶分子中占據(jù)原有金屬離子所在的同一位置。電子構型、離子半徑、配位幾何構型。很關鍵問題：是否能繼續(xù)保持酶分子的生物活性。金屬配位鍵的強弱對于決定反應的途徑也很重要，而這種配位鍵的強度可隨金屬不同而變化。第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日Zn2+的電子結構：d10，在可見區(qū)沒有吸收。在羧肽酶研究中采用Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+，Cd2+，Pd2+等離子取代。Co2+取代的羧肽酶A對肽鍵的水解具有很強的活性。Co2+羧肽酶A的吸收光譜與經(jīng)典的四面體配位的鈷配合物很不同，而且摩爾消光系數(shù)很大，這是由于金屬處在畸變四面體配位引起的；圓二色譜、磁圓二色譜和低溫EPR譜的結果證實這一點。證明鋅酶中的Zn2+處于畸變四面體配位狀態(tài)。第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日碳酸酐酶研究中，鈷酶活性是鋅酶活性的50%，而Ni2+，Mn2+，F(xiàn)e2+酶僅稍具活性，其它惰性。Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。電子結構、離子半徑、配位幾何構型。Co2+配合物有多種幾何構型，高自旋Co(II)配合物優(yōu)先采取四面體結構。四面體場中，高自旋Co2+的電子組態(tài)為e4t23，相當于Zn2+的d10組態(tài)的球對稱結構。采用Co2+作為探針，就能提供鋅酶的金屬結合部位結構的有用信息。第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)羧肽酶羧肽酶是催化肽鏈的C-末端氨基酸殘基水解的酶。第一個被發(fā)現(xiàn)的鋅酶第一個被發(fā)現(xiàn)的金屬酶動力學、結構、光譜最清楚的水解酶羧肽酶分類：金屬酶，存在于胰液中，細胞外酶，幫助蛋白質消化，中性或弱堿性顯示極大的活性非金屬酶（酵母羧肽酶C），細胞內酶，在酸性條件下具有很大活性。第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日一、羧肽酶A1.組成、結構與功能（1）組成：存在哺乳動物胰臟中，相對分子質量34600，

Zn2+作為輔基，單一多肽鏈，約300個氨基酸殘基。研究比較多的是牛的羧肽酶A。羧肽酶原A在胰蛋白酶作用下，一個肽鍵斷裂，釋放出大約60個氨基酸殘基的N-末端裂解物。在不同條件下，可以產(chǎn)生4種不同羧肽酶A：α307;β305;γ300;δ300第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日動物體內羧肽酶原A二聚體或三聚體，無活性胰蛋白酶激活60個氨基酸殘基-N末端裂解物肽鍵斷裂不同條件下α,β,γ,δ四種不同的羧肽酶307，305，300，300通常說的羧肽酶A就是羧肽酶Aα第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日(2)結構：橢球形，羧肽酶A(α)大約一半的氨基酸形成α-螺旋結構或β-折疊結構。第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日其余氨基酸無確定模式，相對容易變形，與底物結合相聯(lián)系的構象變化主要在這些容易變形的部分發(fā)生。酶分子中部一狹長的空腔，底物結合位置。底物的C－末端沿這條溝槽伸入到酶分子內的活性部位，空腔中還有一定數(shù)量的水分子，Zn2+就處于這條空腔的內表面，它是維持羧肽酶A活性所必須的組分。第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日Zn2+與多肽鏈的兩個組氨酸（69,196）的咪唑基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以配位鍵結合，第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日Zn2+第４配位為水。Zn2+處于畸變四面體配位狀態(tài)中。第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日〔3〕功能：催化蛋白質或多肽的羧基末端肽鍵的水解反應。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各種C-末端氨基酸的肽鏈水解。底物的C-末端側鏈為芳基或分支較大的脂基羧肽酶顯示出很強的活性。

―NH―CH―CO―NH―CH―COO-+H2O→||R2R1―NH―CH―COOH+NH2―CH―COO-||R2R1第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.肽水解的催化機理（1）活性部位早期的蛋白鏈化學修飾法已經(jīng)確定羧肽酶的活性部位。Zn2+除與組氨酸（His-69)、-196，以及Glu-72形成直接參與催化作用的活性部位外，還包括Arg-145，Tyr-248和Glu-270，它們的側聯(lián)基團也是直接與底物結合的部位。當上述氨基酸與其他物質作用而被化學修飾時，酶失去活性第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日（2）鋅-羰基機理主要特征：底物的C-末端肽鍵的羰基通過鋅的配位作用而極化，極化羰基的碳原子由于親核反應發(fā)生水解作用。第一步：Arg-145的胍基和底物的帶負電荷的C-末端羧基相互吸引。第二步：底物酪氨酸殘基的芳基側鏈進入酶的非極性口袋形空腔中擠走4H2O。第三步:底物敏感肽鍵的-NH-基上的氮原子與酶的Tyr-248的-OH以氫鍵連結。第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日第四步：底物肽鍵上的羰基擠走了水分子而與鋅配位，鋅使羰基極化以致碳原子容易接受親核進攻。第五步：底物末端的羰基碳原子通過一個插入的水分子與酶的谷氨酸Glu-270的側鏈以氫鍵連結。但最后這一步不一定發(fā)生。羧肽酶與甘氨酰胺結合的過程，必須通過活性中心的重排，特別是酶分子的構象的重大改變才能實現(xiàn)。Arg-145和Glu-270移動0.2nm，Arg的位移帶動了肽鏈的扭轉，使Tyr-248移動了1.2nm。第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日誘導喫合狀態(tài)：酶分子構象改變，配位鍵、范德華力、靜電吸引力和氫鍵等作用力，使酶分子與底物在空間和電荷上都很匹配，因而處于喫合狀態(tài)。羧肽酶與甘氨酰胺結合正是酶的誘導喫合狀態(tài)的范例。酶分子構象改變和各種相互作用力使底物肽鍵處于張力狀體下，因此，反應活化能大大降低。第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日酶與底物結合后進一步反應的步驟有兩種不同的觀點。第一種：Glu-270激活了水分子，提高了水分子的氧的親核能力，向底物肽健羰基的碳原子進攻，Glu-270羰基質子化，Tyr-248也提供一個質子，肽鍵斷裂，底物分解。第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二種：第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日鋅的作用：在鋅-羰基機理中起了使肽鍵產(chǎn)生張力的作用，從而促進了底物的水解。由于Zn2+的作用，底物肽鍵的羰基碳原子的電子云密度降低而呈正電性，因此羰基碳原子更容易接受親核進攻。底物末端羧基與Arg-145帶正電的胍基連結，觸發(fā)了Tyr-248大幅度位移，酶顯示活性。由此可見：酶與底物的誘導喫合是一個互相識別的動態(tài)過程。這個過程發(fā)生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包圍而發(fā)生催化。第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)：碳酸酐酶廣泛存在動物、植物和某些微生物體內。可逆催化二氧化碳的水合作用，還能催化醛類水合作用和某些脂的水解。碳酸酐酶分含Zn2+酶和不含Zn2+酶。鋅酶，紅細胞中僅次于血紅蛋白。第三十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日一、組成、結構、功能相對分子量約30000，單一肽鏈，每個分子含一個Zn2+，260個氨基酸殘基，脯氨酸含量較高，沒有二硫鍵。通常碳酸酐酶指碳酸酐酶B。