周四下午老師-遺傳學實驗2二

細胞與遺傳實驗王浩細胞與遺傳醫(yī)學系細胞一結果不同應激對細胞的影響及機制探討細胞實驗二細胞實驗二5組細胞給予不同處理正常、缺糖損傷、藥物處理現(xiàn)象的觀察

（細胞存活情況的比較，形態(tài)學觀察）根據(jù)觀察到的現(xiàn)象設計隨后的實驗

（機制相關的探討）實驗內容1.不同的實驗分組相同對照組（Control）

---正常培養(yǎng)的細胞無糖損傷組（Glucosedeprivation，GD）

---給予對數(shù)生長期細胞無糖培養(yǎng)約24小時順鉑20umol/l處理組（DDP20umol/l）---對數(shù)生長期細胞給予順鉑20umol/l處理24小時順鉑40umol/l處理組（DDP40umol/l）---對數(shù)生長期細胞給予順鉑40umol/l處理24小時順鉑60umol/l處理組（DDP60umol/l）---對數(shù)生長期細胞給予順鉑60umol/l處理24小時順鉑

是一種含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑，棕黃色粉末，屬于細胞周期非特異性藥物，對肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴瘤及生殖細胞腫瘤都有治療功效。作用機理順鉑進入體內后，一個氯緩慢被水分子取代，形成[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水分子很容易脫離，從而鉑與DNA堿基一個位點發(fā)生配位。然后另一個氯脫離，[2]

鉑與DNA單鏈內兩點或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結，抑制癌細胞的DNA復制過程，使之發(fā)生細胞凋亡。實驗內容2.檢測指標（1）細胞活力檢測

（2）Giemsa染色（3）Hoechst33258染色cellviabilityassayWST-8檢測噻唑藍(四甲基偶氮唑鹽，MTT)可透過細胞膜進入胞內活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT(淡黃色)還原為難溶于水的藍紫色的Formazan（甲臜）結晶，沉積在細胞中。其形成量與活性呈正相關。該結晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀，在波長492nm測定其光吸收值?？砷g接反映活細胞的數(shù)量變化。introduction

WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色水溶性的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞損傷越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。MTT被線粒體內的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。器材與試劑培養(yǎng)細胞(96孔細胞培養(yǎng)板)酶標儀、移液槍、槍頭等試劑：CCK8檢測試劑盒

DMEM培養(yǎng)液（高糖、無糖）

順鉑（DDP）5mg/mlCellCountingKit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑盒。Cellviabilityassay接種5×104/ml細胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液；分為三組，每組五個平行孔；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對數(shù)生長期）

----此時屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2、24h后，無糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時均應小心）繼續(xù)培養(yǎng)------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基4、吸棄原培養(yǎng)液，加含CCK8試劑（10ul）的無血清DMEM培養(yǎng)基110ul繼續(xù)培養(yǎng)5、37oC孵育1h~2h6、酶標儀450nm波長處測定吸光度7、計算并分析結果（統(tǒng)計分析）Cellviabilityassay(today)GiemsaandHoechst33258stainingGiemsaandHoechst33258staining

Cellmorphology姬姆薩(Giemsa)染液是天青色素，伊紅，次甲藍的混合液。Hoechst33258是藍色熒光染料Giemsastaining吉姆薩染色的原理嗜酸性顆粒為堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質；細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結合，染淡紫色，稱為中性物質。器材與試劑培養(yǎng)細胞于小蓋片(6cm培養(yǎng)皿內)光學顯微鏡、移液槍、槍頭、載玻片等試劑：DMEM培養(yǎng)液（高糖、無糖）

順鉑（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Giemsa工作液（臨用現(xiàn)配）

Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。接種6×104/ml細胞于6cm培養(yǎng)皿（8塊小玻片/皿），每皿4ml培養(yǎng)液；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對數(shù)生長期）

----此時屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（3ml/皿）2、24h后，無糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時均應小心）繼續(xù)培養(yǎng)（3ml/皿）------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基（3ml/皿）GiemsastainingGiemsastaining(today)1.每皿棄原培養(yǎng)基2.PBS洗滌兩次，5min/次，1.5ml/皿3.甲醇固定10min，1.5ml/皿4.Giemsa染色10min，1.5ml/皿5.水洗3到4次，直至背景干凈6.夾取小玻片放置于干燥載玻片上，鏡下觀察GiemsastainingresultsApoptosiscells:細胞皺縮、圓化，胞膜膨出、出泡（blebbing），生成膜包裹的凋亡小體（apoptoticbodies）GiemsastainingresultsGiemsastainingresultsHoechststainingHoechst33258akindofblue-fluorescencedye在細胞中Hochest33258在AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結合?；罴毎蚬潭毎蓮娜芤褐袛z取該染料。從而使細胞核著色。器材與試劑96孔板熒光顯微鏡、移液槍、槍頭、載玻片等試劑：DMEM培養(yǎng)液（高糖、無糖）

順鉑（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Hochest33258工作液

接種5×104/ml細胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對數(shù)生長期）

----此時屬正常培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM）1、24h后，Control組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2、24h后，無糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時均應小心）繼續(xù)培養(yǎng)------GD組3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為20umol/l，40umol/l，60umol/l的培養(yǎng)基Hochest33258stainingHoechst33258staining(today)1.棄原培養(yǎng)基2.PBS洗滌兩次，5min/次，200ul/孔3.甲醇固定5-10min4.PBS洗滌三次，5min/次，200ul/孔5.Hoechst33258染色37oC25min，25ul/孔(置于抽屜中，避光)6.PBS洗滌3次，5min/次Hoechst33258stainingresultNucleusofapoptosiscells

胞核固縮、破碎

染色質凝聚、邊集等Hoechst33258stainingresultHoechst33258stainingresultGi