XXXXB第講基因工程第講概論

第二章

基因工程（Geneengineering）

1概論2要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本過程

3、熟悉工具酶和載體類型及應(yīng)用

4、熟悉原核、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染、表

達(dá)的基本方法和類型。

5、熟悉基因工程產(chǎn)生的基礎(chǔ)和過程

(科研思維與方法）。6.設(shè)計(jì)一個基因克隆的程序。3參考書楚雍烈，現(xiàn)代生物技術(shù)（西安交通大學(xué)講義）Genecloning,T.A.Brown.基因工程原理，吳乃虎編著，科學(xué)出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學(xué)出版社。4

生物技術(shù)的核心內(nèi)容

基因工程（Geneengineering）DNA重組（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）DNA克?。―NAcloning）基因修飾（genemodification）

5基因工程的概念基因工程的意義基因工程的發(fā)展史理論上的六大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的六大進(jìn)展發(fā)展過程中的重大事件基本步驟:兩個水平，六個階段內(nèi)容提要6一、基因工程的概念

定義：

人們按照預(yù)定設(shè)計(jì)，在體外對不同來源DNA分子進(jìn)行人工切割、連接、插入載體DNA分子，使遺傳物質(zhì)重新組合、改造，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到原先不含有重組體的受體細(xì)胞，使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴(kuò)增、表達(dá)，獲得人類所需的產(chǎn)品的工程。7WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)8基因工程的基本內(nèi)涵

基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。體外重建、基因轉(zhuǎn)移和外源表達(dá)是重組DNA技術(shù)的三大環(huán)節(jié)。9基因工程的基本特征基因工程有兩個重要的特征：

一是可把來自任何生物的基因重組和轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，因此可以實(shí)現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；

二是某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因復(fù)制和表達(dá)，為準(zhǔn)備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。10基因工程的的目的（1）獲得得目的基因因，DNA的提取、、純化和DNA分子子的克隆，，建立文庫。（2）制備備活性多肽肽產(chǎn)品：激激素、細(xì)胞胞因子子、多多肽藥物疫疫苗等，診斷和防治治疾疾病。（3）研究究基因結(jié)構(gòu)、、功能等11二、基因工工程的重大大意義（1）重組組DNA技技術(shù)填平了了生物種屬屬間不不可逾越的的鴻溝?？缭教烊晃镂锓N屏障，，將原核和和真核生物物、植物和和動物，造造福人類，，在過去人人們難以置置信的事情情，現(xiàn)在已已成為現(xiàn)實(shí)實(shí)。12（2）重組組DNA技技術(shù)縮短了了進(jìn)化時(shí)間間。遺傳和變異異是一對矛矛盾，遺傳傳賦予生物物種的穩(wěn)定定，變異賦賦予生物種種的進(jìn)化。。在漫漫歷歷史長河中中，自然變變異的進(jìn)化化時(shí)間是千千萬年，常常規(guī)育種亦亦要幾年；；而重組DNA技術(shù)術(shù)將進(jìn)化時(shí)時(shí)間大大縮縮短至幾年年。基因操操作用于育育種，將縮縮短進(jìn)化時(shí)時(shí)間，在解解決全世界界人民溫飽飽問題上將將發(fā)揮重要要作用。13（3）重組組DNA技技術(shù)使人類類能對生物物進(jìn)進(jìn)行行定向改造造重組DNA技術(shù)標(biāo)志志著人類控控制和改造造生物的歷歷史已進(jìn)入入一個新紀(jì)紀(jì)元。以重重組DNA技術(shù)培育育出抗真菌菌蔬菜為例例，幾丁質(zhì)質(zhì)是真菌細(xì)細(xì)胞的組分分之一，幾幾丁質(zhì)酶能能水解幾丁丁質(zhì)，美國國科學(xué)家將將幾丁質(zhì)酶酶基因?qū)肴胛骷t柿、、土豆、萵萵苣和甜菜菜中，正準(zhǔn)準(zhǔn)備大田試試驗(yàn)，這一一技術(shù)將對對蔬菜抗真真菌感染具具有重要意意義。14（4）利用用重組DNA技術(shù)可可以在體外外大量擴(kuò)增增、純化人人們感興趣趣的基因，，研究其結(jié)結(jié)構(gòu)、功能能及調(diào)控機(jī)機(jī)制，從而而拓

寬了了分子生物物學(xué)的研究究領(lǐng)域。15（5）醫(yī)學(xué)學(xué)上應(yīng)用更更為廣泛，，涉及各領(lǐng)領(lǐng)域正常人類生生命活動的的分子機(jī)制制；人人類各各種疾病發(fā)發(fā)生的分子子機(jī)理；人人類各種疾疾病如遺傳傳性疾病、、腫瘤、肥肥胖胖、心血管管疾病、傳傳染病等病病因的的查明、、診斷、治治療和預(yù)防防。藥藥物的研研發(fā)和生產(chǎn)產(chǎn)；疾疾病模型型的建立；；人人類的營養(yǎng)養(yǎng)、健康、、長壽和保保健（亞健康））1617本課程的地地位：現(xiàn)代科技革革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克隆18基因工程不不是發(fā)現(xiàn)，，而是創(chuàng)造造。19改變傳統(tǒng)農(nóng)農(nóng)業(yè)概念讓植物生產(chǎn)產(chǎn)人體蛋白白質(zhì)生產(chǎn)促性腺絨毛激素的矮牽牛20發(fā)光的水稻21只有想想不到到的沒有辦辦不到到的基因重組22第一節(jié)基因工程的的發(fā)生與發(fā)展展23一、基因工工程誕生的的理論基礎(chǔ)礎(chǔ)20世紀(jì)中中期分子遺遺傳學(xué)理論論的重大進(jìn)進(jìn)展六大發(fā)現(xiàn)：1．確定了了生物遺傳的物質(zhì)質(zhì)基礎(chǔ)是DNA肺炎鏈球菌菌光滑型和和粗糙型的的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)噬菌體DNA轉(zhuǎn)化實(shí)實(shí)驗(yàn)24●1944年年，美國微微生物學(xué)家家Avery證明基基因就是DNA分子子，提出DNA是是遺傳信息息的載體。。252．DNA分子子雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)模型和半保留復(fù)制制DNA堿基基配對規(guī)律律和X衍射射研究DNA雙螺螺旋結(jié)構(gòu)模模型。26273．生物遺遺傳的“中心法則則”解決了遺傳傳信息的流流向和遺傳傳性狀的相相互關(guān)系，，揭示了生生命遺傳信信息傳遞基基本規(guī)律。。自我復(fù)制，，遺傳信息息由親代傳傳給子代；；通過轉(zhuǎn)錄，，遺傳信息息傳給RNA；通過翻譯，，信息傳給給蛋白質(zhì)和和酶；基因型決定定生物的表表型。DNARNAprotein28ReplicationReplicationTranscriptionReverseTranscriptionTranslation中心法則（thecentraldogma）29304．“操縱子””學(xué)說揭示了了基因表達(dá)達(dá)和和調(diào)控的概概念。基因組結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因分分布基基因因表達(dá)基基因調(diào)控的的原理酶酶誘導(dǎo)的的本質(zhì)315．破譯了了全部生物物遺傳密碼，確定了它在在生物界的的通用性性，人人類更加具具體地了解解遺遺傳信息表表達(dá)規(guī)律。。32遺傳密碼表表目錄33mRNA分分子上從5至3的方向,每3個核苷酸酸構(gòu)建一個個密碼子，，編碼某一一特定氨基基酸或作為為蛋白質(zhì)合合成的起始始、終止信信號，稱為為三聯(lián)體密碼(tripletcodon)，，也稱遺傳密密碼子(geneticcodon)。解決了信息語語言的對應(yīng)關(guān)關(guān)系。34終止密碼：翻譯終止的密密碼，不代表表任何氨基酸酸。有3個：：UAA、UAG、UGA?代表氨基酸的的密碼：64?3=61起始密碼：AUG在mRNA起起始部位時(shí)為為起始密碼。。否，為Met密碼。密碼:43=64351)通用性性遺傳密碼具有有的特點(diǎn)從原核生物到到人類都使用用同一套遺傳傳密碼。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例例外，如動物物細(xì)胞的線粒粒體、植物細(xì)細(xì)胞的葉綠體體。2)方向性性mRNA分子子上由起始密密碼AUG開開始，從5→3方向閱讀密碼碼子，直至終終止密碼。決定蛋白質(zhì)分分子從N端→→C端的排列列順序。363)連續(xù)續(xù)性三聯(lián)體密碼連連續(xù)性表現(xiàn)為為中間無標(biāo)點(diǎn)點(diǎn)，連續(xù)閱讀讀。mRNA開放放閱讀框架內(nèi)內(nèi)發(fā)生一個或或兩個堿基插插入或缺失，，可引起移碼突變(frameshiftmutation)。。374)簡并性性目錄即有多個密碼碼子特異地破破譯同一個氨氨基酸．遺傳密碼中，，除色氨酸和和甲硫氨酸僅僅對應(yīng)一個密密碼子外，其其余氨基酸均均有一個以上上密碼子為其其編碼。385)擺動動性tRNA上反反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的的第3位堿基配對時(shí)，，可以在一定定范圍內(nèi)變動動，即并不嚴(yán)格遵循循堿基配對規(guī)律，這一現(xiàn)現(xiàn)象稱為擺動性。396、生物進(jìn)化，基基因突變、獲得的性狀可可以遺傳到后代。40分子遺傳學(xué)理理論上的六大大進(jìn)展解決了了生命現(xiàn)象的遺遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)礎(chǔ)（均是核酸酸）結(jié)構(gòu)模型（同同類構(gòu)件、雙雙螺旋）復(fù)制方式（相相似的機(jī)制））遺傳信息流動動方向（共同同的中心法則則）遺傳密碼（共共用一套相同同的密碼）表達(dá)和調(diào)控的的機(jī)理（類同同的方法）基因突變機(jī)理理、意義（變變異與進(jìn)化））為基因工程技技術(shù)的誕生典典定了理論基基礎(chǔ)。理論上的可行行性。41二、分子遺傳傳學(xué)新方法是是基因工程的的技術(shù)基礎(chǔ)（六大技術(shù)）首當(dāng)其沖的是是要解決：①如何自如如地得到目的的基因；②如何在體體外改造基因因，得到重組組體；③如何在體體外轉(zhuǎn)移重組組基因；直到20世紀(jì)紀(jì)70年代中中期，相繼出出現(xiàn)了幾項(xiàng)關(guān)鍵性技技術(shù)，夢想成成真。421．工具酶的的發(fā)現(xiàn)：DNA分子的的切割和連接接技術(shù)1970年Smith發(fā)發(fā)現(xiàn)了第一個個Ⅱ型限制性性核酸內(nèi)切酶酶(restrictionendonuclease，，RE)HinfⅠ對DNA分子有特異地切切割作用。（手術(shù)刀剪））同年Khorana又發(fā)發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶酶（Ligase），能將DNA片片段連接在一一起。（縫紉機(jī)、漿漿糊）DNA、RNA聚合酶和和反轉(zhuǎn)錄酶等等合成酶。（復(fù)印機(jī)）構(gòu)成了一個研研究DNA、、RNA分分子的工具酶箱。432、DNA片片段載體系統(tǒng)的構(gòu)建目的基因、DNA片段不不能復(fù)制，也也易破壞。必必須連到具有有復(fù)制能力的的DNA分子子上。載體（vector)是能攜帶外源源DNA、能能自我復(fù)制的的小DNA分分子。最早發(fā)現(xiàn)的是是：質(zhì)粒、噬噬菌體和病毒毒。443、大腸桿菌菌受體細(xì)胞系統(tǒng)統(tǒng)建立體外獲得的含含目的基因或或DNA片段段的重組體，，雖具有自我我復(fù)制的本能能，但沒有原原料、酶系統(tǒng)統(tǒng)和生命活力力。必須將其其安全轉(zhuǎn)移到到宿主細(xì)胞才才能進(jìn)行增殖殖，賦予其““生命”。454、大腸桿菌菌DNA轉(zhuǎn)化體系建立1970年發(fā)發(fā)現(xiàn)氯化鈣處處理過的細(xì)胞胞易于吸收接接納外源DNA；1972年CohenC報(bào)道，質(zhì)質(zhì)粒DNA也也能被大腸桿桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過過改造的質(zhì)粒粒、噬菌體和和病毒都可以以攜帶目的DNA片段和和基因，經(jīng)過過轉(zhuǎn)化大腸桿桿菌，建立該該基因的無性性繁殖系。465、DNA分析、鑒定技術(shù)酶切分析技術(shù)術(shù)（核酸分辨儀）核酸分子雜交交技術(shù)（核酸酸探測儀）序列分析（密密碼復(fù)讀機(jī)）生物信息學(xué)（（密碼破譯機(jī)）476、DNA分離、純化及及鑒定技術(shù)凝膠電泳：Agarose,PAGEgel離心技術(shù)層析技術(shù)印跡技術(shù):Southernblot………..48技術(shù)上的可行性六大技術(shù)方法法的建立實(shí)際上的可操作性材料、實(shí)驗(yàn)條條件、時(shí)空條條件、經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)條件和政策策。基礎(chǔ)方面的基基本條件（可能性+可行行性+可可操作性）具備，尚需需人的科學(xué)創(chuàng)新思維+艱艱苦的的實(shí)踐。才能得到創(chuàng)新新的發(fā)明、發(fā)發(fā)現(xiàn)和和成果。491970年，，MIT的的科學(xué)家率率先提出在體體外把不同來來源的遺傳物物質(zhì)進(jìn)行重組組的設(shè)想，但但遭到反對，，不予支持。。沒能進(jìn)行試試驗(yàn)。1972年，，Boyer等在發(fā)現(xiàn)現(xiàn)限制性核酸酸內(nèi)切酶EcoRI的的基礎(chǔ)上，，開始了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。501972年Berg等人人使用EcoRI在體外外對猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別別酶消化，再再用T4DNA連接酶酶將兩種片段段連接起來，，得到SV40和λλDNA的的重組雜種DNA分子，率先完成了世世界上第一次次成功的DNA體外不同物種之間間的DNA重組組實(shí)驗(yàn)（片段段重組）。基因工程的大大膽嘗試51基因工程的誕誕生1980年Nobel化化學(xué)獎1972年斯坦福大學(xué)學(xué)的PaulBerg小組完成了了首次體外重重組實(shí)驗(yàn)。Berg的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)521973年Cohen成功地地進(jìn)行了另一一個體外DNA重組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。分別把編碼卡卡那霉素和四四環(huán)素抗性基基因的兩種質(zhì)質(zhì)粒酶切、連連接，再將這這種重組的DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌，某些轉(zhuǎn)化化菌落具有既既抗卡那霉素素又抗四環(huán)素素的雙重抗體體特性。他的工作是世世界上第一次次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)，并有基基因表達(dá)及新新的表型。標(biāo)志著基因工工程的誕生。。53pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基基因DNA連接酶酶重組DNA分分子54培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌55后來又把非洲洲爪蟾核糖體體基因片段同同pSC101質(zhì)粒重組組，轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌，并在在菌體內(nèi)成功功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)應(yīng)的mRNA。這是第一一次成功的基基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。561974年，，首次實(shí)現(xiàn)異源源間基因重組組。把把小鼠鼠的生長激素素抑素基因在在大腸桿菌中中表達(dá)。571976年，，世界上第一個個基因公司在在美國成立，，“Genetech””注冊登記，，意味著基因因工程的實(shí)際際應(yīng)用已跨入入商業(yè)運(yùn)作的的門檻。生生物工程從此此進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化化。581978年，人類的第一個個基因被克隆隆。人生長激激素抑素基因因被重組到大大腸桿菌的質(zhì)質(zhì)粒DNA中中。1978-1979胰島素基因在在大腸桿菌中中表達(dá)。591982年1、把大白鼠鼠的生長激素素基因克隆、、轉(zhuǎn)移到小鼠鼠的受精卵內(nèi)內(nèi)，第一個個轉(zhuǎn)基因超級級鼠誕生。2、人胰島素素基因的cDNA被克克隆、成功表表達(dá)和開始成成為商品上市市?；虍a(chǎn)品有效效益、開始新新興產(chǎn)業(yè)。60三、基因工程程的基本步驟驟——兩個水水平，六個階階段61基因工程包括括分子和細(xì)胞胞兩個水平操操作分子水平操作作指的是基因因重組、克隆隆和表達(dá)的設(shè)設(shè)計(jì)與重組體體構(gòu)建（即重重組DNA技技術(shù)）；細(xì)胞水平操作作則指轉(zhuǎn)化、、篩選和培養(yǎng)養(yǎng)工程菌或細(xì)細(xì)胞以及表達(dá)達(dá)產(chǎn)物的分離離純化過程。。621．分子水平平操作階段：：獲得含目的基基因的重組體體分子（亦稱稱重組子）。。本階段的操作作有三個主要要環(huán)節(jié)：（1）分離：提取、分分離含目的基基因的DNA分子和載體體DNA分子子，在分離提提取過程中，，注意質(zhì)、量量，減少損傷傷。（（2）切割：選擇合適適的RE工具具酶，分別對對外源目的DNA分子和和載體DNA分子進(jìn)行酶酶解切割。（（3））連接：用DNA連接酶，將將目的基因與與載體在體外外連接為一個個重組DNA分子，并進(jìn)進(jìn)行鑒定。63分離：目的基因的獲獲取需要克隆的DNA片段：：化學(xué)合成法cDNA文庫庫基因組DNA文庫聚合酶鏈?zhǔn)椒捶磻?yīng)64載體DNA的的選擇功能：為目的基因提提供進(jìn)入受體體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。為目的基因提提供在受體細(xì)細(xì)胞中復(fù)制或整合能力。為目的基因提提供在受體細(xì)細(xì)胞中的表達(dá)能力。65限制性內(nèi)切酶酶切切割：內(nèi)切酶連接酶連接：DNA連接酶酶662.細(xì)胞水平平操作階段：：把含目的基因因的重組體導(dǎo)導(dǎo)入受體細(xì)菌菌或受體細(xì)胞胞，賦予其其“生命”讓讓其表達(dá)，獲獲得產(chǎn)品。本階段的操作作也有三個主主要環(huán)節(jié)。（1）轉(zhuǎn)移：利用DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)術(shù)，把構(gòu)建的的重組體導(dǎo)入入到受體菌或或受體細(xì)胞中中，獲得工程程菌或工程細(xì)細(xì)胞。

（2）篩選：利用核酸酸雜交，酶切切分析、PCR和表型特特征等技術(shù)，，篩選出已克克隆化的工程程菌/細(xì)胞。。（3）表達(dá)：大量培養(yǎng)養(yǎng)含重組體的的工程菌/細(xì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其其表達(dá)，并對對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行鑒定，提提取和純化。。67重組體的轉(zhuǎn)化化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移：含氨芐平板重組質(zhì)粒感受態(tài)重組體68含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉(zhuǎn)化重組體克隆的的篩選與鑒定定篩選：宿主細(xì)胞69外源基因在宿宿主細(xì)胞中的的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）工程細(xì)胞表達(dá)：目的基因表達(dá)達(dá)產(chǎn)物的檢測測70重組DNA操操作一般步驟驟：（1）分離：提取和獲得得目的基因和載體DNA；（2）切割：分別對目的的基因和載體體DNA酶切；（3）連接：目的基因與與載體連接，，形成新的重組組DNA分分子；（