sod活性測(cè)定-西南大學(xué)精

超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定植物葉片在衰老過(guò)程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過(guò)程的變化。近來(lái)大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。過(guò)剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)。生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基主要有超氧自由基（02「）、羥自由基（OH.）、過(guò)氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物細(xì)胞膜有酶促和非酶促兩類過(guò)氧化物防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶?？箟难幔╒c）、Ve和還原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。SOD、CAT等活性氧清除劑的含量水平和O2.-、H2O2、OH.和O2等活性氧的含量水平可作為植物衰老的生理生化指標(biāo)。自1968年發(fā)現(xiàn)SOD后，立刻引起科學(xué)界的高度重視，近40年來(lái)這方面的研究進(jìn)展非常迅速，它的應(yīng)用領(lǐng)域日益拓寬，SOD也有了產(chǎn)品。二十世紀(jì)80年代后期，我國(guó)關(guān)于SOD的研究及應(yīng)用也形成了熱點(diǎn)，如今已在化妝品添加劑、飲料及醫(yī)藥方面顯示了特殊效果。超氧自由基（O.-）是生物細(xì)胞某些生理生化反應(yīng)常見(jiàn)的中間產(chǎn)物。自由基2是本身帶有不成對(duì)價(jià)電子的分子、原子、原子團(tuán)或離子，化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡腔钚匝醯囊环N。如果細(xì)胞中缺乏清除自由基的酶時(shí)，機(jī)體就會(huì)受到各種損傷。超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase）,簡(jiǎn)稱SOD,能通過(guò)歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2-）,生成H2O2和O2。H2O2由過(guò)氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2,從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害?！币?、目的學(xué)習(xí)和掌握氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法測(cè)定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的ROD：Mn—SOD和Cu.Zn—SOD,它們都催化下列反應(yīng)：匕,31-11—二"L二“二］以卜，I1/2（卜由于超氧自由基(02-)為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測(cè)定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來(lái)測(cè)定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子02「，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲月替(黃色)，繼而還原生成二甲月替，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長(zhǎng)下有最大吸收。當(dāng)加入50口時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H202和02,從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲月替生成速度減慢。通過(guò)在反應(yīng)液中加入不同量的S0D酶液，光照一定時(shí)間后測(cè)定560nm波長(zhǎng)下各液光密度值，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比，以酶液加入量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出二者相關(guān)曲線，根據(jù)S0D抑制NBT光還原相對(duì)百分率計(jì)算酶活性。找出S0D抑制NBT光還原相對(duì)百分率為50%時(shí)的酶量作為一個(gè)酶活力單位(U)。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑.實(shí)驗(yàn)材料小麥、玉米、水稻、棉花等新鮮葉片.主要儀器722型或其他型號(hào)的可見(jiàn)分光光度計(jì)(2)萬(wàn)分之一分析天平(3)高速冷凍離心機(jī)(4)冰箱(5)光照箱：4500Lux(6)帶蓋瓷盤(pán)1個(gè)/處理(7)移液管架(8)研缽(9)離心管5mL數(shù)個(gè)(10)微燒杯10?15mL8個(gè)/處理(11)移液管或加樣器0.5mLX4；1mLX2；2mLX2；5mLX1

(12)微量進(jìn)樣器50uLX2；100uLX2(12)微量進(jìn)樣器50uLX2；100uLX2(13)燒杯 50mLX3； 100mLX5； 500mLX1； 1 000mLX2(14)量筒 50mLX1； 100mLX2(15)容量瓶 50mLX1； 100mLX5； 250mLX1； 1 000mLX2(16)細(xì)口瓶125mLX5.試劑0.1mol/LpH7.8磷酸鈉(Na2HPOjNaH2P0/緩沖液A液(0.1mol/LNa2Hp04溶液)：準(zhǔn)確稱取Na2HPOj12H20(MW=358.14)3.5814g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后,移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。B液(0.1mol/LNaH2P04溶液)：準(zhǔn)確稱取NaH2POj2H20(MW=156.01)0.780g于50mL小燒杯中,，用少量蒸餾水溶解后，移入&。!^容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液183mL與B液17mL充分混勻后即為0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.026mol/L蛋氨酸(Met)磷酸鈉緩沖液準(zhǔn)確稱取L-蛋氨酸(C5HliN02S,MW=149.21)0.3879g于100mL小燒杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻(現(xiàn)用現(xiàn)配)。4℃冰箱中保存可用1?2d。(3)7.5X10-4mol/LNBT溶液準(zhǔn)確稱取NBT(C40H30cl”006,MW=817.7)0.1533g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。4℃冰箱中保存可用2?3d。(4)含1.0umol/LEDTA的2X10-5mol/L核黃素溶液A液：準(zhǔn)確稱取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。B液：準(zhǔn)確稱取核黃素(MW=376.36)0.0753g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，此溶液為含0.1mmol/LEDTA的2mmol/L核黃素溶液。4℃冰箱中保存可用8?10d。該溶液應(yīng)避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。當(dāng)測(cè)定SOD酶活時(shí)，將C液稀釋100倍，即為含1.0umol/LEDTA的2義10-5mol/L核黃素溶液。(5)0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液取0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液501^,移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?6)石英砂。四、操作方法和步驟.酶液的制備按每克鮮葉加入3mL0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液，加入少量石英砂，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，定容到5mL刻度離心管中，于8500r/min(10000g)冷凍離心30min,上清液即為SOD酶粗提液。.酶活力的測(cè)定每個(gè)處理取8個(gè)洗凈干燥好的微燒杯編號(hào)，按表1加入各試劑及酶液，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3mL。其中4?8號(hào)杯中磷酸鈉緩沖液量和酶液量可根據(jù)試驗(yàn)材料中酶液濃度及酶活力進(jìn)行調(diào)整(如酶液濃度大、活性強(qiáng)時(shí)，酶用量適當(dāng)減少)。各試劑全部加入后，充分混勻，取1號(hào)微燒杯置于暗處，作為空白對(duì)照，比色時(shí)調(diào)零用。其余7個(gè)微燒杯均放在溫度為25℃,光強(qiáng)為4500Lux的光照箱內(nèi)(安裝有3根20W的日光燈管)照光15min,然后立即遮光終止反應(yīng)。在560nm波長(zhǎng)下以1號(hào)杯液調(diào)零，測(cè)定各杯液光密度并記錄結(jié)果。以2、3號(hào)杯液光密度的平均值作為抑制NBT光還原率100%,根據(jù)其他各杯液的光密度分別計(jì)算出不同酶液量的各反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對(duì)百分率。以酶液用量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，作出二者相關(guān)曲線。找出50%抑制率的酶液量(口L)作為一個(gè)酶活力單位(U)。表1反應(yīng)系統(tǒng)中各試劑及酶液的加入量（1^）試劑杯號(hào)試劑（5）試劑（2）試劑（3）酶液試劑（4）00.300.300.340.850.350.8000.360.750.370.7000.380.650.3五、結(jié)果計(jì)算560nm波長(zhǎng)下各杯液的光密度（表2）表2測(cè)定數(shù)據(jù)列表杯號(hào) 12345678 2、3號(hào)平均值TOC\o"1-5"\h\z酶液量（mL）0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 —光密度（OD560nm 0抑制率（％） — 100 100 100以酶液加入量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出二者相關(guān)曲線。找出50%抑制率的酶液量（口L）作為一個(gè)酶活力單位（U）。SOD酶活力按下式計(jì)算AV義1000義60= BXWXT式中各因子代表內(nèi)容如下：A：為酶活力（酶活力單位：U/g（FW）-h）；V：為酶提取液總體積（mL）；B：為一個(gè)酶活力單位的酶液量（HL）；W：為樣品鮮重（g）；T：為反應(yīng)時(shí)間（min）；1000：為1mL=1000hL；60：為1h=60min。抑制率按下式計(jì)算抑制率=D1-D2 X100%D1式中各因子代表內(nèi)容如下：Dj為2、3號(hào)杯液的光密度平均值；D2：為加入不同酶液量的各杯液的光密度值。注：有時(shí)因測(cè)定樣品的數(shù)量多，每個(gè)樣品均按此法測(cè)定酶活力工作量將會(huì)很大，也可每個(gè)樣品只測(cè)定1個(gè)或2個(gè)酶液用量的光密度值，按下式計(jì)算酶活力。（D]—D2）XVX1000X60一 D1XBXWXTX50%式中各因子代表如下：Dj為2、3號(hào)杯液的光密度平均值；D2：為測(cè)定樣品酶液的光密度；50%：為抑制率50%；其它各因子代表的內(nèi)容與上述SOD酶活力計(jì)算公式的各因子代表的內(nèi)容相同。六、注意事項(xiàng).富含酚類物質(zhì)的植物（如茶葉）在勻漿時(shí)產(chǎn)生大量的多酚類物質(zhì)，會(huì)引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此類植物SOD酶時(shí)，必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑，將多酚類物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活，一般在提取液中加1?4%的聚乙烯毗咯烷酮（PVP）。.測(cè)定時(shí)的溫度和光化反應(yīng)時(shí)間必須嚴(yán)格控制一致。為保證各微燒杯所受光強(qiáng)一致，所有微燒杯應(yīng)排列在與日光燈管平行的直線上。七、思考題.為什么SOD酶活力不能直接測(cè)得？.超氧自由基為什么能對(duì)機(jī)體活細(xì)胞產(chǎn)生危害，SOD酶如何減少超氧自由基的毒害？參考答案1.由于超氧自由基（02-）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，反應(yīng)過(guò)程不易控制，測(cè)定的結(jié)果也不精確，所以測(cè)定SOD活性一般采用間接方法。2.自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡腔钚匝醯囊环N。植物在逆境脅迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。過(guò)剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞