等電聚焦電泳

會計(jì)學(xué)1等電聚焦電泳基本原理

等電聚焦電泳(IEF)是利用兩性電解質(zhì)載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中則帶正電荷，向負(fù)極移動；若其處在高于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中，則帶負(fù)電向正極移動。當(dāng)泳動到其自身特有的等電點(diǎn)時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點(diǎn)位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。第1頁/共20頁

如果在電泳系統(tǒng)中建立一個由陽極至陰極，pH由低到高（即環(huán)境由酸到堿）的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度，則處于一個系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)分子，將根據(jù)各自的pI值與所處位點(diǎn)的oH值的差別帶上正電或負(fù)電。第2頁/共20頁第3頁/共20頁載體兩性電解質(zhì)pH梯度(carrierampholytepHgradient)等電聚焦，即在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度。固相pH梯度(immobilizedpHgradients,IPG)等電聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點(diǎn)附近形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價聚合，形成固定的、不隨環(huán)境電場條件變化的pH梯度，分辨率可達(dá)0.001pH。載體兩性電解質(zhì)/固相pH梯度混合技術(shù)，即在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)作為添加劑，被稱為“雜交等電聚焦”。固相pH梯度等電聚焦與載體兩性電解質(zhì)等電聚焦的區(qū)別在于前者不是兩性分子，在凝膠聚合時便形成pH梯度.后者是兩性分子，在電場中兩性分子遷移到自己的等電點(diǎn)而形成pH梯度。IEF的分類第4頁/共20頁pH梯度的形成

等電聚焦也是在電場下進(jìn)行的一種精密分離技術(shù)，但由于必須在電場的方向附加一個pH場，利用各溶質(zhì)遷移到pH等于其等電點(diǎn)的位置時便停止在那里而被分離。故技術(shù)的關(guān)鍵是如何形成穩(wěn)定的pH場以及減小對流、擴(kuò)散、散熱以及電滲的影響。對于制備型的分離設(shè)備，解決以上諸問題的難度更大。多種建立pH梯度的方法：在電場下利用不同pH值緩沖溶液相互擴(kuò)散，在混合區(qū)間形成pH梯度，稱人工pH梯度。但這種pH梯度易受緩沖溶液離子的遷移和擴(kuò)散而變動，重復(fù)性差，已不被采用。利用溫度梯度建立pH梯度。因?yàn)闇囟瓤梢杂绊懢彌_液的解離度，從而使pH值改變。由于每差別一個pH單位溫度約50℃，故這種方法只能建立范圍很窄的pH梯度，而且不易穩(wěn)定。第5頁/共20頁加入附加物質(zhì)建立pH梯度。通過把一些有機(jī)溶劑如乙醇、甘油等加到緩沖液中，利用附加物的介電常數(shù)的變化，改變了緩沖液一些組分的解離常數(shù)，可以形成1.5pH單位的pH梯度。如在硼酸鹽溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖，可以形成pH為7~8.6范圍的梯度，可分離血紅蛋白。在電極間放入含多種不同等電點(diǎn)電解質(zhì)的溶液，通電后在電極間便會形成pH梯度。這些兩性電解質(zhì)大多是一些多胺基多羧酸化合物。為了防止對流對pH梯度的干擾，可以采用加入不同濃度的中性或惰性物質(zhì)形成密度梯度的方法，也可以采用在電極間加入凝膠的方法。利用固定化兩性載體形成pH梯度。就是把具有緩沖能力的基團(tuán)或化合物用共聚或接枝的方法固定在載體上形成兩性載體。載體可以是聚丙烯酞胺凝膠或葡聚糖等。被固定的化合物可以是帶羧基的酸或帶叔胺基的堿。采用這種方法可以形成穩(wěn)定的pH梯度。但成本太高。第6頁/共20頁固定化兩性載體和兩性緩沖液相結(jié)合。利用離子交換劑建立pH梯度。Sluyterma(1978)利用離子交換劑建立一個有pH梯度的柱進(jìn)行等電聚焦，稱為色譜聚集。由外循環(huán)建立的pH梯度，Rilbe(1978)在兩電極室把溶液進(jìn)行循環(huán)，以在電泳分離室中建立一個穩(wěn)定的pH梯度，稱為流動電解。緩沖液更新的方法。在電泳過程中，溶液的離子會產(chǎn)生電遷移。在兩個電極室中離子的消耗或積累，可由外部加和或取出加以平衡，以維持電泳池中緩沖液的組成和pH等流量泵不變。流動電解第7頁/共20頁兩性介質(zhì)載體的選擇易溶于水，理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物質(zhì)不起化學(xué)反應(yīng)，也無變性作用。pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。第8頁/共20頁電場下載體兩性電解質(zhì)的變化

在沒有電場時,載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷，只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等，凈電荷為零。引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動，最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移。(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì)，電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì)，電正性最強(qiáng)，具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI，一直向陽極順延。第9頁/共20頁第10頁/共20頁pH梯度支持介質(zhì)

常用的pH梯度支持介質(zhì)是凝膠，主要有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。第11頁/共20頁循環(huán)流動等電聚焦示意圖

循環(huán)等電聚焦這里表示了兩個流程。一個是用虛線連接的A、C室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到A、C室。消耗掉的電解質(zhì)由V補(bǔ)充。另一個流程是從A室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到C室，V＝0。為了防止對流作用，腔室厚度不宜超過5mm.目前多采用2mm或更小。等電聚焦電泳裝置第12頁/共20頁分段固定化pH梯度裝置示意圖2.分段固定化pH梯度裝置

A、B是固定化兩性電解質(zhì)段，C段為充滿載體液段，用一泵把液體循環(huán)。最后雜質(zhì)都收集到正、負(fù)極上，只余下等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在循環(huán)。利用這個設(shè)備可以處理大量液體和分離大量的蛋白質(zhì)，而且收率很高，存在的缺點(diǎn)是固定化兩性電解質(zhì)能夠水解，使pH場破壞。第13頁/共20頁常用電泳儀

第14頁/共20頁簡單操作步驟

配膠：膠液組成為載體兩性電解質(zhì)，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質(zhì)等。灌膠：注意不要產(chǎn)生氣泡。冷卻2h后可接入電泳池。加電極液電泳樣品收集檢測第15頁/共20頁等電聚焦電泳的優(yōu)缺點(diǎn)準(zhǔn)確度和精確度較高，操作簡單。IEF分離在較低的工作電壓下(20V/cm)進(jìn)行，可以避免蛋白質(zhì)上專一結(jié)合（以共價鍵等強(qiáng)作用力結(jié)合，一定程度上依賴于蛋白質(zhì)的構(gòu)象)的金屬在電場作用下的丟失，這部分金屬大多構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性中心或結(jié)構(gòu)中心，比非專一結(jié)合金屬具有更重要的生物學(xué)意義。在樣品分離方面，載體兩性電解質(zhì)pH梯度的重現(xiàn)性仍然是難以解決的問題。選用固態(tài)pH梯度可以提高分辨率，加大上樣量，受到樣品中鹽的干擾小，無邊緣效應(yīng)，并有很好的重現(xiàn)性，這對建立微量元素種態(tài)分布數(shù)據(jù)庫這樣的工作是必需的．分辨率高。等電聚焦電泳屬于非變性蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，其分辨率至少可達(dá)0.01pH單位。第16頁/共20頁pH梯度不穩(wěn)定現(xiàn)象IEF實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷進(jìn)步的同時，卻一直存在著pH值梯度不穩(wěn)定的現(xiàn)象，即存在著pH梯度的陰極和陽極漂移現(xiàn)象。陰極漂移是指在IEF實(shí)驗(yàn)中pH梯度的堿性端逐漸消失的過程；反之，如果其酸性端逐漸消失則稱為陽極漂移。為了闡明IEF中pH值梯度不穩(wěn)定的機(jī)制，出現(xiàn)了各種假說：載體兩性電解質(zhì)向陰、陽極的等速電泳（ITP）遷移；在陰極因CO2的吸附而引起陰極液組分和濃度的變化；在pH梯度的中性區(qū)域生成一段純水，水的IEF導(dǎo)致水在電泳管中的聚集并向兩端反流；不同等電點(diǎn)載體兩性電解質(zhì)的選擇性缺陷而引起的不穩(wěn)定；兩性電解質(zhì)帶電配體的進(jìn)行性地結(jié)合或分離引起的不穩(wěn)定；載體兩性電解質(zhì)相互反應(yīng)的存在而引起的不穩(wěn)定性；相對遷移的氫離子和氫氧根離子濃度的不平衡。第17頁/共20頁等電聚焦電泳的應(yīng)用

IEF是一種簡便、快速、高效的分離分析方法，特別適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶類和抗體等的分離分析，能夠滿足組分定量、雜質(zhì)檢出、質(zhì)量控制、臨床診斷等方