第7章蛋白質(zhì)分離純化

第三章氨基酸掌握：氨基酸的分類、酸堿化學(xué)及化學(xué)反應(yīng)熟悉:氨基酸的分子組成了解：氨基酸的光學(xué)活性、光譜性質(zhì)及分離純化第四章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)（一）掌握：肽的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系（二）熟悉：蛋白質(zhì)的分子組成、分類（三）了解：蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能第五章蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（一）掌握：蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系（二）熟悉：穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力第六章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）掌握：肌紅蛋白與血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）熟悉：血紅蛋白分子病的生化原理第七章蛋白質(zhì)的分離純化和表征（一）掌握：蛋白質(zhì)的分離和純化方法（二）熟悉：蛋白質(zhì)的分子組成、理化性質(zhì)（三）了解：蛋白質(zhì)的分離和純化的評(píng)價(jià)第七章蛋白質(zhì)分離、純化和表征蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能整體的生物化學(xué)描述來自于對(duì)于許多個(gè)別蛋白質(zhì)的研究。為了詳細(xì)地研究一個(gè)蛋白質(zhì),必須將其從細(xì)胞中存在的所有其它蛋白質(zhì)中分離出來,還必須有一些可用的技術(shù)來測(cè)定其特征。蛋白質(zhì)性質(zhì)

pI(Isoelectricpoint)等電點(diǎn)Colloid(膠體)Precipitation(沉淀)Denaturation(變性)Ultravioletlightabsorption(紫外吸收)Colourreaction(顏色反應(yīng))（一）蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。一、理化性質(zhì)

凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏堿性，如組蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏酸性，人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH5.0左右，所以在體液中以負(fù)離子形式存在。

ProteinProperties:pI

(Isoelectricpoint)氨基酸的等電點(diǎn)為其特征值。而對(duì)蛋白質(zhì)來說,只有在無其它鹽類存在的條件下測(cè)得的所謂“等離子點(diǎn)”對(duì)每種蛋白質(zhì)才是特征值。

中性鹽（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42-）影響滴定曲線形狀和等電點(diǎn)。等電點(diǎn)測(cè)定:溶解度法和聚焦電泳法等電聚焦分離蛋白質(zhì)的過程蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽(yáng)極移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于該蛋白質(zhì)分子pI。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。等電聚焦過程+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10＋－1098765432pHpI＝8.0蛋白質(zhì)pI＝4.0蛋白質(zhì)等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)pI二、

蛋白質(zhì)的大小與形狀測(cè)分子量的方法：★化學(xué)組成法測(cè)定最低分子量★SDS法★凝膠過濾法★滲透壓法★擴(kuò)散系數(shù)法★沉降系數(shù)法和沉降平衡法第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的大小與形狀一、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量：假定某種微量成分只有一個(gè)，測(cè)出其百分含量后，可用比例式算出最低相對(duì)分子質(zhì)量。若測(cè)出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對(duì)分子質(zhì)量不相同時(shí)，可計(jì)算兩個(gè)最低相對(duì)分子質(zhì)量近似的最小公倍數(shù)。例題：一種純酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含異亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相對(duì)分子質(zhì)量。解：按照Leu的百分含量計(jì)算，最低MrX1：X1=(100×131)/1.65=7939.4。按照Ile的百分含量計(jì)算最低MrX2：X2=(100×131)/2.48=5282.3。由于X1和X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含Leu和Ile不止1個(gè)，為了估算Leu和Ile的個(gè)數(shù)，首先計(jì)算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。這種酶含任何氨基酸的個(gè)數(shù)均應(yīng)是整數(shù)，說明該酶至少含有2個(gè)Leu，3個(gè)Ile，其最低相對(duì)分子質(zhì)量為：7939.4×2=15878.8或5282.3×3=15846.9。四、凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量

當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。

log

SDS是陰離子表面活性劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成SDS-蛋白復(fù)合物，蛋白質(zhì)分子即帶大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過原來所帶的電荷，使天然蛋白質(zhì)分子之間的電荷差別降低，甚至可以忽略。同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致基本原理（電荷效應(yīng)）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)大小在1-100nm范圍內(nèi)；同種電荷互相排斥；質(zhì)點(diǎn)外圍有水化層。（二）蛋白質(zhì)的沉淀

1.鹽析法

2.有機(jī)溶劑沉淀法

3.重金屬鹽沉淀法

4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法

5.加熱變性沉淀法蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬(wàn)至100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

1.鹽析(saltprecipitation)

在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。鹽析法不引起蛋白質(zhì)的變性。常用如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等。原理：蛋白質(zhì)表面電荷被中和水化膜被破壞（三）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。

有機(jī)溶劑具有脫水劑功能，使蛋白質(zhì)的水化膜脫去。如乙醇、丙酮；（等電點(diǎn)、低溫、短時(shí)間條件）常用于實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)的提取。丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。2.有機(jī)溶劑法3.重金屬鹽法重金屬離子帶正電荷與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的沉淀。(醋酸鉛)蛋白質(zhì)與重金屬結(jié)合成鹽共沉淀，蛋白質(zhì)變性，用于除蛋白。蛋白質(zhì)帶負(fù)離子臨床：蛋白質(zhì)制劑＋催吐劑4.生物堿試劑法某些酸：鞣酸、苦味酸、烏酸、三氯醋酸等能與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生不溶性的沉淀。蛋白質(zhì)變性，無蛋白濾液的制備。由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。⒉雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)

G－250染料在酸性條件下和蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色物質(zhì)，波長(zhǎng)由465nm變成595nm。可進(jìn)行定量檢測(cè)。蛋白質(zhì)分離純化的一般原則

一、前處理要選擇合適的材料;合適的破碎方法;合適的提取液。二、粗分級(jí)分離要方法簡(jiǎn)便，處理量大。常用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法，有時(shí)可用超過濾或凝膠過濾等方法。三、細(xì)分級(jí)分離主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結(jié)晶法。①在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。②在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。③各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。首要了解生物大分子的理化性質(zhì)：④固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。⑤其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。⑥對(duì)其他生物分子的特殊親和力。目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和離心三大技術(shù)。（一）透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子（二）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離等電點(diǎn)沉淀鹽析、有機(jī)溶劑沉淀*超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。

*蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。超速離心因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀的高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析。層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。（四）層析蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。目錄目錄蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)

。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

（二）電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。1.凝膠過濾分離蛋白質(zhì)是基于各種蛋白質(zhì)的（）A.不同的電荷狀態(tài)B.不同的分子量C.不同的溶解度D.不同的親和性E．分配系數(shù).SDS分離蛋白質(zhì)是基于各種蛋白質(zhì)的（）A．不同的分子量B.不同的親和性C.不同的溶解度D.不同的荷電狀態(tài)E.以上都不是5.蛋白質(zhì)變性不涉及（）A.分子形狀的改變B.溶解度的改變C.生物學(xué)功能的改變D.肽鍵的斷裂E.磷酸二酯鍵的斷裂1.蛋白質(zhì)是由哪些元素組成的？其基本結(jié)構(gòu)單元是什么？寫出其結(jié)構(gòu)通式。

2.蛋白質(zhì)中有哪些常見的氨基