光譜分析四熒光分析法

光譜分析四熒光分析法第一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日2

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法一、概述

1、熒光光度分析法由激發(fā)態(tài)能級(jí)回到基態(tài)能級(jí)的過(guò)程中以光的形式放出多余的能量，并發(fā)射出比原波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光譜，這一過(guò)程稱分子發(fā)光，檢測(cè)分子發(fā)射光譜的分析方法稱為熒光光度分析法。第二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法一、概述2、熒光分析特點(diǎn)專一性強(qiáng)靈敏度高選擇性強(qiáng)發(fā)光發(fā)式多可分析參數(shù)多返回

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第三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日4

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法二、分子發(fā)光的理論較高電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)以熱和無(wú)輻射的形式釋放能量最低第一級(jí)電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)以光子的形式釋放能量基態(tài)分子能量吸收過(guò)程λ磷光熒光發(fā)射熒光和磷光的示意圖第四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日5

常見(jiàn)的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光熒光和磷光的主要區(qū)別:

①熒光:激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過(guò)程持續(xù)10-9-10-6s

磷光:發(fā)光過(guò)程持續(xù)10-4-10s②熒光是從最低單線激發(fā)態(tài)發(fā)出，磷光則由最低三重態(tài)能級(jí)發(fā)出。

二、分子發(fā)光的理論第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日耗能方式

①在同一能級(jí)中分子間的相互碰撞消耗能量；②無(wú)輻射衰減轉(zhuǎn)給周圍分子變成振動(dòng)消耗；③輻射熒光——以光子的形式釋放能量；④光分解消耗分子內(nèi)部的能量。6

第六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日分子熒光的類型物理發(fā)光指熒光分子吸收了光能而產(chǎn)生的熒光，稱為物理發(fā)光。也稱光致熒光。化學(xué)發(fā)光是指分子與分子之間的化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)能，在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中釋放能量而發(fā)射熒光。也稱化學(xué)熒光。生物發(fā)光通過(guò)生物體內(nèi)的熒光酶與熒光物質(zhì)相互作用，在生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所釋放出來(lái)的光能。也稱生物熒光。7

第七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日8

激發(fā)光譜:固定測(cè)量波長(zhǎng)為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長(zhǎng)，然后改變激發(fā)波長(zhǎng)，以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，即可繪制。發(fā)射光譜:固定激發(fā)光波長(zhǎng)為其最大激發(fā)波長(zhǎng)，然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，將熒光的光波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖便可得到熒光光譜第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)射光源激發(fā)光源激發(fā)光譜波長(zhǎng)發(fā)射光譜波長(zhǎng)熒光分子激發(fā)光源激發(fā)光譜波長(zhǎng)發(fā)射光譜波長(zhǎng)熒光分子發(fā)射光源(改變波長(zhǎng))選擇最大發(fā)射波長(zhǎng)固定波長(zhǎng)(改變波長(zhǎng))激發(fā)光譜測(cè)試示意圖發(fā)射光譜測(cè)試示意圖9

第九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日10

第十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日11

熒光量子產(chǎn)率φ分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：

a分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光提供輻射能；b分子吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子的能力。產(chǎn)生熒光量子的強(qiáng)弱可以用熒光產(chǎn)率φ表示。它是熒光分子發(fā)射熒光的能為參數(shù)。（也稱熒光效率或量子效率)。

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日12

熒光過(guò)程的量子效率φf(shuō):

如kf>>kc和kx，φf(shuō)→1。如kc或kx>>kf，則φf(shuō)→

0。kf——熒光發(fā)射的速度常數(shù)；kc和kx——為其它有關(guān)速度常數(shù)的總和。第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日13

對(duì)低濃度溶液樣品，保持一定最大發(fā)射波長(zhǎng)和最大激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)得熒光強(qiáng)度If可表示為：If=2.303I0

bcI0——為激發(fā)光強(qiáng)度；b——

為液池厚度；C——

為濃度；——摩爾吸光系數(shù)在一定條件下：If=Kc

熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比

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第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日14

熒光猝滅（熒光熄滅）：

廣義的說(shuō)，指任何可使物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的作用，任何可使熒光強(qiáng)度不與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的作用，或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。狹義的說(shuō)，指熒光分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過(guò)程。熒光猝滅劑：與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)，稱-。第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日15

三、熒光分析儀器第一章第二節(jié)熒光分析法光源激發(fā)單色器樣品池吸收光譜檢測(cè)器熒光分光光度示意紫外分光光度示意第十五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日熒光分光光度計(jì)根據(jù)發(fā)射光譜的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的紫外分光光度計(jì)是根據(jù)吸收光譜設(shè)計(jì)的,二者差異主要有：測(cè)光角度不同單色器位置不同比色杯不同熒光檢測(cè)器與入射光源方向成90角，對(duì)面為暗背景。紫外的檢測(cè)器位置與入射光源平行。熒光計(jì)的單色器設(shè)在檢測(cè)器前面，樣品的發(fā)射光經(jīng)單色器分光后進(jìn)入檢測(cè)器。紫外計(jì)單色器設(shè)在樣品池前面。熒光計(jì)使用的是四面透光的樣池，紫外計(jì)使用的是兩面透光的樣池16

第十六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日儀器名稱：日立850型熒光分光光度計(jì)儀器型號(hào)：日立850儀器名稱：PerkinElmerLS50B型發(fā)

光光譜儀儀器型號(hào)：LS50B主要技術(shù)指標(biāo)：

波長(zhǎng)范圍：200-850nm；

波長(zhǎng)精度：±1.2nm，發(fā)射狹縫：

2.5-20nm

狹縫范圍：激發(fā)狹縫：2.5-15nm；

發(fā)射濾光片：290,350,390,430,

530nm（通過(guò)計(jì)算機(jī)選

擇），樣品池：1cm

熒光池信噪比：62：1水拉曼峰測(cè)定，

狹縫10nm）主要技術(shù)指標(biāo)：

波長(zhǎng)范圍：200-900nm；

波長(zhǎng)精度：±1.0nm；分辨率：

￡0.15nm

狹縫范圍：0.15-20nm

信噪比：20：1（水拉曼峰測(cè)定，

狹縫5nm）

發(fā)射濾光片：290,350,390,430,

530nm（通過(guò)計(jì)算機(jī)選

擇）樣品池：1cm熒光池第十七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日基本功能：

(1)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜；

(2)ms級(jí)發(fā)光壽命測(cè)定；

(3)熒光、磷光測(cè)定；

(4)液體、固體樣品測(cè)定第十八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日19

激發(fā)光源——

作用：提供連續(xù)輻射，激發(fā)樣品要求：光源（I0）強(qiáng)度足夠；強(qiáng)度與波長(zhǎng)無(wú)關(guān)種類：汞弧燈、氫燈或氙燈。激發(fā)單色器----

作用：置于光源和樣品之間的為激發(fā)單色器或第一單色器,篩選出特定的激發(fā)光源。

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日20

樣品池——用石英制成，形狀:正方形、長(zhǎng)方形、圓形的。低溫測(cè)定時(shí)在石英液槽外套一個(gè)盛放液氮的透明石英真空瓶。發(fā)射單色器——用于選擇投射到檢測(cè)器的熒光波長(zhǎng)。檢測(cè)器——熒光或磷光的強(qiáng)度較弱，要求檢測(cè)器靈敏度高。

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第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第二十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日四、分析方法1、定量分析①標(biāo)準(zhǔn)曲線法同紫外可見(jiàn)光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法②內(nèi)標(biāo)法在一定濃度范圍內(nèi)，選擇一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，測(cè)得值與同樣條件下的未知樣品值進(jìn)行比較未知樣品濃度（mg/mL）=（A1/A2）×CA1——未知樣品的熒光發(fā)光值A(chǔ)2——標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光發(fā)光值C——標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度21

第二