免疫檢驗(yàn)第十二章免疫組化

免疫檢驗(yàn)第十二章免疫組化第一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日活體組織：組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）；大?。?×1×0.5cm）；取病變組織與正常組織交界處；避免對(duì)組織標(biāo)本的損傷和擠壓。印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織(經(jīng)新鮮標(biāo)本最大面積剖開(kāi)，充分暴露病灶，將載玻片輕輕壓與組織切面，細(xì)胞粘附于玻片上，然后固定）（缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞有重疊）各種體液、穿刺液：可直接涂片（血液、組織液等）或離心后涂片（細(xì)胞少腦脊液、腹水等）。培養(yǎng)細(xì)胞：懸浮細(xì)胞離心后涂片；貼壁細(xì)胞可爬片。取材時(shí)間要早（24小時(shí)以?xún)?nèi)），避免組織自溶，使抗原變性消失或嚴(yán)重彌散。組織切塊厚度不易超過(guò)0.5cm，以便固定液的及時(shí)滲透及脫水。第二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日①凝固蛋白，終止細(xì)胞內(nèi)酶的作用,防止細(xì)胞自溶；固定細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)②保持組織細(xì)胞的抗原性③防止細(xì)胞層脫落④去除細(xì)胞內(nèi)的脂類(lèi)（妨礙抗體結(jié)合）⑤防腐

不損傷組織細(xì)胞的固有形態(tài)、結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞膜的通透性；不干擾固定后的抗原與抗體的識(shí)別與結(jié)合。固定時(shí)間：一般12小時(shí)內(nèi)，不易超過(guò)24小時(shí)。第三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日固定劑的選擇：所有的標(biāo)本固定必須根據(jù)其性質(zhì)及所進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。如甲醇、丙酮、甲醛等（根?jù)抗原的耐受性選擇）

缺點(diǎn)：抗原容易被掩蓋，特別是甲醛固定后，形成醛鍵或羧甲基，使蛋白交聯(lián)封閉部分抗原表位。第四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日能做石蠟切片的就能做冰凍切片，能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片

石蠟切片：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保存好，對(duì)組織的定位很準(zhǔn)確，是觀察組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法，可以用于回顧性研究。缺點(diǎn)：抗原常被封閉和破壞。對(duì)抗原的保存不如冰凍切片。冰凍切片：優(yōu)點(diǎn)：能避免石蠟切片因固定，脫水，浸蠟等對(duì)抗原的損失，較好的保存組織抗原的免疫活性，適用于不穩(wěn)定的抗原。缺點(diǎn)：不易保存（-800C）；細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞抗原結(jié)構(gòu)，造成抗原的彌散使定位不準(zhǔn)確。

第五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日二、抗原的保存與修復(fù)抗原修復(fù):免疫組化在制片的過(guò)程中由于廣泛的蛋白交聯(lián)而使其組織的某些抗原決定簇發(fā)生遮蔽、致使免疫細(xì)胞化學(xué)的信號(hào)減弱或消失等不良效應(yīng)。使遮蔽的組織抗原決定簇重新暴露的方法，即抗原修復(fù)。第六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日常用的方法有：

酶消化法：胃蛋白酶、胰蛋白酶和無(wú)花果酶鹽酸水解暴露抗原法：注意溫度和時(shí)間微波爐恢復(fù)抗原法：微波是一種高頻電磁波，可以打開(kāi)蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)健，從而使抗原修復(fù)。高壓鍋恢復(fù)抗原法煮沸恢復(fù)抗原法抗原修復(fù)液中的化學(xué)成分或離子與部分抗原表位結(jié)合產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，增加了細(xì)胞和組織的通透性，便于抗原抗體的充分結(jié)合。高溫可以使某些已經(jīng)封閉的抗原表位得以重新暴露和修復(fù)第七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日三、抗體的處理與保存（一）抗體的選擇注意選擇具有高特異性、穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)抗體多克隆抗體：敏感性較高、特異性相對(duì)較低單克隆抗體：特異性較高、敏感性相對(duì)較低（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)要比例合適才能達(dá)到預(yù)期效果使用前根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出抗體的最佳稀釋度第九頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）抗體的保存分裝密封保存，避免對(duì)抗體的污染并注明標(biāo)記（批號(hào)、名稱(chēng)、效價(jià)、量）根據(jù)廠家提供的保存條件保存避免反復(fù)凍融而使抗體效價(jià)降低第十頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日(三）陰性結(jié)果和抗原不表達(dá)（五）免疫組化結(jié)果與HE染色結(jié)果(一）必須設(shè)立對(duì)照（二）陽(yáng)性結(jié)果（四）特異性染色與非特異性染色四、免疫組化的結(jié)果判斷第十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日確證實(shí)驗(yàn)

(一）必須設(shè)立對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)替代試驗(yàn)吸收或阻斷試驗(yàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：

陽(yáng)性對(duì)照：選擇含已有抗原的標(biāo)本(證明顯示程序正確，尤其實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性時(shí)更為重要）陰性對(duì)照：選擇不含已知抗原的標(biāo)本（排除假陽(yáng)性）第十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日確證實(shí)驗(yàn)：

空白實(shí)驗(yàn)：PBS（排除內(nèi)源性酶）

替代試驗(yàn)：同一動(dòng)物免疫前的非免疫血清（證明陽(yáng)性反應(yīng)不是由異嗜性抗原引起的非特異性反應(yīng)）（這可證明待檢切片中陽(yáng)性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果。）

吸收或阻斷試驗(yàn)：用過(guò)量的已知抗原與特異性抗體反應(yīng)，本已經(jīng)是陽(yáng)性的標(biāo)本應(yīng)呈陰性（證明免疫組化的陽(yáng)性結(jié)果是與天然抗原相同的抗原抗體反應(yīng)。）第十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日顯色分布:（二）陽(yáng)性結(jié)果可以作為判定抗原定位的依據(jù)（三）陰性結(jié)果及抗原不表達(dá)第十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（四）特異性染色與非特異性染色

特異性染色

非特異性染色分布在特定的部位，顯色不均一無(wú)分布規(guī)律，均勻顯色特異性染色非特異性染色分布在特定的部位,具結(jié)構(gòu)性無(wú)分布規(guī)律，常出現(xiàn)在切片邊緣、刀痕或皺折部位及壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)域由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，所以顯色不均一不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，均勻顯色陽(yáng)性與陰性細(xì)胞相互交雜，同一切片上顯色強(qiáng)度不一細(xì)胞和周?chē)慕Y(jié)締組織均無(wú)區(qū)別的著色第十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日出現(xiàn)假陰性的原因第十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因第十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（五）免疫組化結(jié)果與HE染色結(jié)果第十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日五、質(zhì)量控制（一）試劑質(zhì)量控制

抗體特異性、敏感性測(cè)試,抗體最佳稀釋度的選擇,稀釋劑,抗體孵育溫度、時(shí)間非特異性染色：縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（二）儀器的質(zhì)量控制相關(guān)技術(shù)設(shè)備、儀器和器具定期校對(duì)、消毒第十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）操作過(guò)程質(zhì)量控制操作：步驟是否正確規(guī)范；每日之間、操作人員之間的變異；試劑復(fù)溶、狀態(tài)是否良好標(biāo)本：陰性、陽(yáng)性或自身組織對(duì)照三種類(lèi)型質(zhì)控品，可用于監(jiān)控標(biāo)本制備、操作過(guò)程、染色步驟、試劑質(zhì)量等問(wèn)題引起的誤差第二十頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日★酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶標(biāo)記已知抗體（抗原），與標(biāo)本中靶抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，在顯微鏡下識(shí)別標(biāo)本中抗原（抗體）的分布位置和性質(zhì)，也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。第二十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)本處理與熒光免疫相似標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，可用普通顯微鏡觀察分類(lèi)酶標(biāo)記抗體免疫組化非標(biāo)記抗體酶免疫組化一、組織處理

第二十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日★原理

酶直接標(biāo)記在抗體上，與靶抗原反應(yīng)，通過(guò)酶對(duì)底物的特異性催化作用，產(chǎn)生的有色物質(zhì)沉積在靶抗原部位，從而對(duì)靶抗原定位、定性和定量檢測(cè)。二、酶標(biāo)記抗體免疫組化染色第二十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日直接法抗原標(biāo)本載玻片優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高缺點(diǎn)：敏感度偏低、抗體制備麻煩標(biāo)記抗體底物第二十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)記二抗體間接法抗原優(yōu)點(diǎn)：敏感度高缺點(diǎn)：特異性偏低,操作繁瑣底物第二十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日★原理

用酶免疫動(dòng)物制備抗酶抗體，再將組織抗原與抗酶抗體結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)酶的底物顯色而檢測(cè)抗原，避免了用酶標(biāo)記時(shí)對(duì)抗體的損傷，提高了檢測(cè)敏感性。PAP法酶橋法

雙橋PAP法APAAP法三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色第二十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體，通過(guò)第二抗體作橋抗體，將結(jié)合在組織抗原上的第一抗體與第三抗體連接起來(lái)，最后形成酶聯(lián)的抗原-抗體復(fù)合物，底物顯色第二十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

抗酶抗體抗原優(yōu)點(diǎn)：敏感性比酶標(biāo)法高缺點(diǎn)：操作繁瑣底物酶橋法橋抗體酶第二十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

優(yōu)點(diǎn)：

敏感性較酶標(biāo)法有所提高

缺點(diǎn)：

操作分四步，較復(fù)雜如果抗酶抗體與酶結(jié)合弱，在操作中酶常被沖洗掉如果酶標(biāo)記在非特異性抗體上會(huì)存在背景著色問(wèn)題如果抗酶抗體的非特異性成分與橋抗結(jié)合，結(jié)果就與抗酶抗體競(jìng)爭(zhēng)橋抗的結(jié)合位點(diǎn)，也會(huì)影響方法的敏感性

+++HRP底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源抗酶抗體/Ab3Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物AgAgAgAg第二十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）PAP法：是酶橋法的改良法。PAP法將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶形成一種穩(wěn)定可溶性(PAP復(fù)合物)

第三十頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日抗原底物PAP法橋抗體

PAP復(fù)合物第一抗與第三抗的動(dòng)物種屬須相同第三十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日操作只需三步

PAP復(fù)合物穩(wěn)定，酶不易洗脫，避免了酶橋法的弊端大大減弱背景著色①橋連抗體存在的非特異性抗體，因其與第1抗體并非同種屬，不能與抗酶抗體結(jié)合②抗酶抗體中存在的非抗酶抗體，雖可與組織成分結(jié)合，但此抗體不能與酶結(jié)合，不會(huì)有酶活性。+++底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源PAP復(fù)合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-PAP復(fù)合物第三十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）雙橋PAP法基本原理:是在PAP法中通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP而建立起來(lái)的，通過(guò)雙橋可結(jié)合更多的PAP復(fù)合物于抗原分子上。這種放大方式由于重復(fù)使用橋抗體，使橋抗與PAP復(fù)合物中的抗酶抗體未充分飽和的Fc段結(jié)合，或橋抗體與特異性一抗尚未飽和的Fc段結(jié)合。對(duì)抗原有明顯放大作用，對(duì)于組織細(xì)胞微量抗原的檢測(cè)更有實(shí)用價(jià)值。第三十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

抗原底物雙橋PAP法橋抗體第一抗與第三抗的動(dòng)物種屬須相同

PAP復(fù)合物第三十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日四、酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物常用種類(lèi):

辣根過(guò)氧化物酶/HRP底物顯色（DAB)棕色或灰藍(lán)色(AEC)最常用

堿性磷酸酶/AP

底物顯色玫瑰紅色(α-萘酚磷酸鹽與快紅反應(yīng)）或深藍(lán)色(α-萘酚磷酸鹽與快藍(lán)反應(yīng)）;靛藍(lán)四唑（紫藍(lán)色）最敏感

葡萄糖氧化酶/GO

底物為葡萄糖，配以NBT和PMS顯色藍(lán)色敏感性較低，顯色底物不易保存

β-半乳糖酶等酶的選擇:

HRP染色結(jié)果比AP染色結(jié)果保存時(shí)間長(zhǎng)含有內(nèi)源性HRP的組織切片:首選標(biāo)記酶為APAP和HRP結(jié)合可進(jìn)行雙重或3重免疫組化標(biāo)記,對(duì)比清晰第三十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

采用熒光素標(biāo)記已知抗體（或抗原）作為探針，檢測(cè)標(biāo)本中靶抗原（或抗體），在熒光顯微鏡下，分辨出抗原(或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算其含量。以達(dá)到對(duì)抗原(或抗體）物質(zhì)定位、定性和定量測(cè)定的目的?！餆晒饷庖呓M織化學(xué)技術(shù)第三十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日一、組織的處理標(biāo)本的類(lèi)型：涂片和印片組織切片細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本活細(xì)胞標(biāo)本的保存：標(biāo)本固定干燥后，最好立即檢測(cè)保持干燥、置4℃甚至-20℃以下保存第三十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日二、熒光免疫組化染色

直接法：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高

缺點(diǎn)：敏感度偏低、抗體制備麻煩

間接法：

優(yōu)點(diǎn)：較直接法靈敏，標(biāo)記一種抗體可以鑒定多種抗原

缺點(diǎn)：非特異熒光、操作時(shí)間較長(zhǎng)

第三十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日雙標(biāo)記熒光免疫染色法用兩種熒光素分別標(biāo)記不同抗體，對(duì)同一標(biāo)本中的相應(yīng)兩種抗原同時(shí)檢測(cè)

標(biāo)記抗體A抗原A抗原B標(biāo)記抗體B標(biāo)本載玻片第三十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日親和組織化學(xué)（Affinityhistochemistry）

利用兩種物質(zhì)之間的高度親合力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如植物凝集素（與蛋白糖基）、生物素（親和素）和葡萄球菌A蛋白（IgGFC段結(jié)合）等，都對(duì)某種組織成分具有高親和力的特點(diǎn)，可以與標(biāo)記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合,可采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)、放射自顯影或電子顯微鏡，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位或定量。第四十頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶ABC直接法原理示意圖原理：預(yù)先按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合形成可溶性的ABC復(fù)合物。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體相遇時(shí)，ABC中末飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原－抗體反應(yīng)體系與ABC標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。（一)親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)ABC第四十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日ABC間接法原理示意圖待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶原理：預(yù)先按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合形成可溶性的ABC復(fù)合物。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化第二抗體相遇時(shí)，ABC中末飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原－抗體反應(yīng)體系與ABC標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。第四十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

缺點(diǎn)：有些組織如肝、腎、白細(xì)胞、脂肪組織和乳腺等有內(nèi)源性生物素活性，需要對(duì)組織進(jìn)行預(yù)處理

ABC復(fù)合物在中性時(shí)帶正電荷，容易與細(xì)胞核等帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)非特異結(jié)合，親合素為糖蛋白，可以與凝集素等碳水化合物結(jié)合

優(yōu)點(diǎn)：

敏感性高特異性高一抗和二抗工作濃度低操作時(shí)間縮短可以多重標(biāo)記第四十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日(二）橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)

BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB

原理：是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價(jià)性，將檢測(cè)反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素(酶標(biāo)生物素)聯(lián)結(jié)起來(lái)，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)分子的目的。由于生物素化抗體分子上連有多個(gè)生物素，因此，最終形成的抗原-生物素化抗體-親合素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物可積聚大量的酶分子；加入相應(yīng)酶作用底物后，即會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的酶促反應(yīng)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。第四十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日BRAB直接法原理示意圖待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶第四十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日BRAB間接法原理示意圖待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素B-生物素E-酶第四十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）標(biāo)記親和素-生物素技術(shù)

LabelledAvidin-biotintechnique，LAB原理:以標(biāo)記親合素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測(cè)。特點(diǎn):

相當(dāng)高的靈敏度，省略了加標(biāo)記生物素步驟，操作較BRAB法簡(jiǎn)便。間接LAB法采用生物素化第二抗體，可進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度第四十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日二、葡萄球菌A蛋白法定義:葡萄球菌蛋白A/SPA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它能與多種動(dòng)物（人、豬、兔、小鼠等）IgG的Fc段結(jié)合，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第四十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日注意：SPA對(duì)IgG

亞型的結(jié)合有選擇性（如IgG3不結(jié)合），不結(jié)合IgA1,可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：解決不同動(dòng)物樣本檢測(cè)時(shí)，需分別標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的二抗的問(wèn)題。第四十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日三、凝集素法凝集素lectin

是指一類(lèi)從植物種子、無(wú)脊椎動(dòng)物和較高等動(dòng)物組織中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，可使紅細(xì)胞凝集故稱(chēng)凝集素，凝集素具有與特定糖基專(zhuān)一結(jié)合的特性，是研究腫瘤細(xì)胞膜糖分子變化的一種理想工具，凝集素法就是一方面利用凝集素可以與標(biāo)記物結(jié)合，另一方面又可以與細(xì)胞膜糖基結(jié)合所形成一種親合反應(yīng)直接法是將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合。第五十頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日間接法是先將凝集素與組織細(xì)胞膜糖基結(jié)合，然后再用標(biāo)記的抗凝集素抗體與結(jié)合在細(xì)胞上的凝集素反應(yīng)。糖-凝集素-糖法，這種方法是利用生物細(xì)胞膜的特殊糖基與凝集素結(jié)合后，再用標(biāo)記的已知糖基與其反應(yīng)，形成一個(gè)“三明治樣”的結(jié)合物。第五十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日四、鏈霉親合素-生物素法(LSAB）

鏈霉親合素(StreptavidinSA)是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，不含糖基，有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，并且具有高度的親和力，其功能類(lèi)似親合素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親合素蛋白就組合成酶標(biāo)鏈霉親合素-生物素方法第五十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日LSAB法具有幾大特點(diǎn)：可結(jié)合更多的生物素化的二抗，放大效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)ABC法低背景著色操作時(shí)間縮短第五十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日

免疫電子顯微鏡（ImmunoelectronMicroscope，IEM）技術(shù)是利用高電子密度的顆粒性標(biāo)記物（如膠體金、鐵蛋白等）標(biāo)記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物，在電子顯微鏡下對(duì)高電子密度標(biāo)記的抗原（抗體）進(jìn)行亞細(xì)胞水平定位的技術(shù)。

特點(diǎn):

定位更為精確，可定位至細(xì)胞膜、細(xì)胞器在探索病因、發(fā)病機(jī)制、組織發(fā)生等方面有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)一、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)的原理第五十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)本制備的要求是保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，注意保持組織的抗原性，因此在組織固定與取材時(shí)選用固定劑不宜過(guò)強(qiáng)。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。二、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本的制備要求第五十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日第五十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日從動(dòng)物到電鏡照片第五十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日（—）免疫膠體金染色法

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)為膠體金。它在弱堿環(huán)境下可與蛋白質(zhì)分子形成牢固的靜電結(jié)合而不影響蛋白質(zhì)的生物特性。三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)第五十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫金銀法

(ImmuNogoldsilvertechNiqueIGST)。其基本原理是用特異性抗體與抗原反應(yīng)，隨后用金標(biāo)記的間接抗體，再與特異性抗體結(jié)合，用乳酸銀處理，使銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀反應(yīng)而顯示出黑褐色。適用于石蠟切片，冰凍切片，培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞涂片和樹(shù)脂包埋的電鏡切片，該法敏感性高，可檢測(cè)組織中微量抗原，定