免疫檢驗(yàn)第十三章免疫細(xì)胞分離與檢測

免疫檢驗(yàn)第十三章免疫細(xì)胞分離與檢測第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日密度梯度離心(Ficoll)離心第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、淋巴細(xì)胞分離（去單核細(xì)胞）貼壁粘附法

（單核細(xì)胞貼壁生長的特點(diǎn)、將懸液置玻璃或塑料器皿，未貼壁的為淋巴細(xì)胞，此法易造成B流失）吸附柱過濾法

（單核細(xì)胞貼壁生長的特點(diǎn)，將細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠的層析柱中，洗脫下來的為淋巴細(xì)胞）

Percoll分離液法

（連續(xù)密度梯度離心，不同密度的細(xì)胞懸浮于各自不同的密度區(qū)帶）第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日Percoll法分離單個核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日E花環(huán)沉降法（T細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞形成E花環(huán)后用淋巴細(xì)胞分層液分離，E花環(huán)沉在管底）尼龍毛柱分離法（B細(xì)胞和單核細(xì)胞易粘附于尼龍纖維表面，將用HANKS液浸泡后的單個核細(xì)胞懸液加入充填有尼龍毛的聚乙烯塑料管內(nèi)，洗脫液中為T細(xì)胞，然后邊沖邊擠壓塑料管，洗下B細(xì)胞。

三、T、B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的分離第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日大小免疫磁珠分離細(xì)胞的特點(diǎn)比較

比較項(xiàng)目大磁珠小磁珠對細(xì)胞的影響對細(xì)胞造成機(jī)械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細(xì)胞溫和，不影響分離細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細(xì)胞儀的影響阻塞流式細(xì)胞儀的噴嘴，影響散射光?？芍苯由狭魇郊?xì)胞儀檢測，不影響散射光。分離條件要求技術(shù)簡單，分離可在試管中完成。需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞。收率得率高。得率不高。純度純度低。純度高。分離時間分離速度快。分離速度慢。分離成本成本低。需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞，需要一次性的分離柱，不能在普通試管進(jìn)行。第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測及亞群分類

常用于鑒定和檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志是簇分化抗（CD）。

一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性T細(xì)胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcell,TrorTreg）第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日輔助性T細(xì)胞Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β

CD3+CD4+CD30-)Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10

CD3+CD4+CD30+）第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日細(xì)胞毒性T細(xì)胞Tc1（CD3+CD8+CD30-)Tc2（CD3+CD8+CD30+）第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、B細(xì)胞表面標(biāo)志

SmIg、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體、小鼠紅細(xì)胞受體都是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo)。

成熟B細(xì)胞的mIg主要為mIgM、mIgD。CD19/CD5分子：可將B細(xì)胞區(qū)分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞，B1細(xì)胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細(xì)胞僅為CD19陽性，B2細(xì)胞為通常所指的B細(xì)胞。

人類NK細(xì)胞表面標(biāo)志主要以CD16、CD56來認(rèn)定，臨床上將CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞認(rèn)定為NK細(xì)胞。三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志

第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗原提呈細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測抗原提呈類細(xì)胞表面標(biāo)志第四節(jié)淋巴細(xì)胞功能檢測

淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)，間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng).

體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定.第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞分類T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK和K細(xì)胞（非特異性免疫作用）第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細(xì)胞

ConA-------T細(xì)胞

PWM-------T、B細(xì)胞

LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

同位素法：PHA

淋巴細(xì)胞（54h）

DNA合成期+3H-TdR摻入

收集細(xì)胞

檢測β射線

測定細(xì)胞內(nèi)的3H-TdR3.檢測方法形態(tài)法：刺激物淋巴細(xì)胞（4-6天）母細(xì)胞化第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日（1）形態(tài)學(xué)檢查法第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日方法學(xué)評價：優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。（3）MTT比色法第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日(二)T細(xì)胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。

第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞同位素法：淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr

釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日(四)體內(nèi)試驗(yàn)特異性抗原皮膚試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)二、B細(xì)胞功能檢測溶血空斑試驗(yàn)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗(yàn)第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.方法學(xué)：經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn)被動溶血空斑試驗(yàn)

(一)溶血空斑試驗(yàn)溶血空斑試驗(yàn)主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。

第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用與方法學(xué)評價：該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。(二)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、NK細(xì)胞活性測定靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:

K562細(xì)胞株(人）

YAC-1細(xì)胞株(小鼠）第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法染色計(jì)數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細(xì)胞熒光測CPM值測發(fā)光強(qiáng)度方法學(xué)及原理第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日

吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。一、中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)第五節(jié)其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日一、中性粒細(xì)胞功能的檢測