獸用基因工程生物制品的安全性

獸用基因工程生物制品的安全性第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日獸用基因工程生物制品是用微生物、微生物代謝產(chǎn)物、原蟲、血液或組織等加工制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他疾病的制劑。作為畜禽疾病預(yù)防控制的利器，獸用生物制品在畜牧業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用，其研發(fā)和生產(chǎn)應(yīng)用促進(jìn)了畜牧業(yè)的繁榮。由于其本身的特性和安全管理方面的漏洞，在研發(fā)和應(yīng)用中也可能出現(xiàn)某些生物災(zāi)害。概括起來主要有：實(shí)驗(yàn)研究人員的感染、病原微生物對環(huán)境的污染、以及遺傳性狀不穩(wěn)定。獸用生物制品的生物安全問題直接或間接影響人類和動物的身體健康和生命安全。第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)

獸用基因工程生物制品概況目前的獸用基因工程生物制品，可分為基因工程亞單位疫苗、重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗等幾類。1.基因工程亞單位疫苗或基因工程蛋白質(zhì)疫苗通過基因工程將病原微生物的主要免疫原基因在宿主細(xì)胞表達(dá)，再從表達(dá)產(chǎn)物制備而成。其產(chǎn)品或是病原蛋白質(zhì)(或亞單位)，或是其抗原決定簇。這類疫苗可能產(chǎn)生的問題：與原始蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異、異源蛋白質(zhì)對宿主的毒性、細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)對外源基因的識別、T細(xì)胞對蛋白成分非敏感。對上述問題的解決途徑包括：采用真核生物細(xì)胞為宿主、采用能分泌重組蛋白質(zhì)的細(xì)菌為宿主、突變外源基因的糖基化位點(diǎn)。第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日目的基因的獲取工程菌的構(gòu)建目的基因表達(dá)蛋白質(zhì)分離與純化產(chǎn)品第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.

核酸疫苗核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA

或RNA)直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi),并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答,以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)是：免疫保護(hù)力增強(qiáng)、制備簡單、同種異株交叉保護(hù)、持久免疫應(yīng)答。核酸疫苗的缺點(diǎn)是：免疫原性較低、用量大、真核細(xì)胞不存在質(zhì)粒DNA的主動核－質(zhì)間傳輸途徑。提高核酸疫苗免疫原性的嘗試主要有：抗原基因上游插入RNA復(fù)制酶基因、在抗原基因下游插入細(xì)胞因子編碼基因、提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、改變重組質(zhì)粒非編碼區(qū)。核酸疫苗通常不能在動物細(xì)胞中長期復(fù)制或不復(fù)制。第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日3.

重組活載體疫苗重組活載體疫苗包括：重組DNA病毒疫苗和重組RNA病毒疫苗。重組DNA病毒疫苗是將抗原基因轉(zhuǎn)移至病毒DNA載體上而制備的重組DNA疫苗。重組RNA病毒疫苗是將抗原基因轉(zhuǎn)移至病毒RNA載體上而制備的重組RNA疫苗。重組活載體疫苗的優(yōu)點(diǎn)主要在于：宿主體內(nèi)有識別病毒的免疫系統(tǒng)、病毒能主動將其DNA或RNA傳輸至細(xì)胞內(nèi)、表達(dá)量大。重組活載體疫苗的主要不足在于：對免疫力弱者可能致病、容易出現(xiàn)非相關(guān)免疫反應(yīng)、需要避開先天或后天的抗病毒免疫，等等。第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)

獸用基因工程生物制品的安全性獸用基因工程生物制品的應(yīng)用越來越廣泛，其安全性一直受到人們的密切關(guān)注。對獸用基因工程生物制品安全性的考慮，主要在以下幾方面：對使用動物的毒性、致癌的可能性、外源DNA與宿主染色體整合的可能性、誘導(dǎo)產(chǎn)生抗DNA抗體的可能性。對基因工程生物制品使用后的擔(dān)憂主要是持續(xù)表達(dá)外源抗原可能出現(xiàn)的后果：產(chǎn)生耐受性、自動免疫、過敏反應(yīng)和超敏反應(yīng)等，或最終導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)制受抑制而易感染其他病原體。基因工程生物制品安全性評價應(yīng)包括：受體細(xì)胞的安全性、基因操作的安全性、基因重組活疫苗的安全性及工業(yè)化生產(chǎn)的潛在安全性。第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、受體細(xì)胞的安全性受體細(xì)胞是用于制備基因工程生物制品的表達(dá)系統(tǒng)?？煞譃樵吮磉_(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。選擇受體細(xì)胞時應(yīng)重點(diǎn)考慮：

安全性高且不造成生物污染；

便于重組DNA導(dǎo)入；

便于篩選克隆子；

能使重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持；

適合外源基因高效表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物分泌或累積；

對遺傳密碼無偏倚（沒有選擇性表達(dá)）；

遺傳性穩(wěn)定、易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵；

對真核表達(dá)系統(tǒng)還要求有較好的翻譯后加工機(jī)制。

第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日1.

原核生物表達(dá)系統(tǒng)原核生物表達(dá)系統(tǒng)是研究最透徹的表達(dá)系統(tǒng)，常用細(xì)菌作為受體，具有操作簡單、價格低廉、外源基因表達(dá)水平高的特點(diǎn)。最為常用的是大楊桿菌和枯草芽孢桿菌。大腸桿菌是腸道菌群的組成部分，大部分為非致病菌，但某些血清型可引起腹瀉和敗血癥。作為外源基因受體的大腸桿菌菌株遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)?？莶菅挎邨U菌是需氧的革蘭氏陽性菌，細(xì)胞內(nèi)存在著分泌系統(tǒng)，常常能將重組蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中?？莶輻U菌本身沒有致病性，但其可用的載體株有限，外源基因的表達(dá)量也低于大腸桿菌。

第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日大腸桿菌枯草芽孢桿菌第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.真核表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高，但目的蛋白質(zhì)常以包涵體出現(xiàn)而致純化難，缺翻譯后加工而使表達(dá)產(chǎn)物活性較低，促使人們尋找合適的真核表達(dá)系統(tǒng)。目前常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有：酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌的遺傳背景清楚、遺傳操作容易，可微生物化操作，外源基因在酵母細(xì)胞中能分泌表達(dá)，但只能進(jìn)行有限的翻譯后加工修飾。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)多利用桿狀病毒為外源基因載體，利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，但分泌性較差哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞如CHO、COH、BHK、NIH3T3為受體，以病毒或質(zhì)粒為外源基因載體。主要缺點(diǎn)是培養(yǎng)和操作難度大，且不能持久表達(dá)第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日啤酒酵母NIH3T3CHOBHK第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日

二、基因操作的安全性基因操作主要包括：目的基因獲取、載體制備、基因重組、重組子轉(zhuǎn)化與外源基因表達(dá)等步驟。1.目的基因的分子特征表達(dá)載體相關(guān)資料：目的基因與載體圖譜，目的基因供體、結(jié)構(gòu)功能及安全，其他元件安全記錄。目的基因在表達(dá)系統(tǒng)中的整合情況：插入片段的位點(diǎn)、邊界、拷貝數(shù)、全長DNA序列，宿主DNA序列被刪除或基因失活情況。外源插入片段的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)錄水平(RT–PCR,Northern)、翻譯水平(ELISA,Western)。第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日藍(lán)舌病毒BL3基因-pFB1表達(dá)載體第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

基因的遺傳穩(wěn)定性基因操作的遺傳穩(wěn)定性主要涉及質(zhì)粒的穩(wěn)定性，包括分離穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性鑒定時，應(yīng)從幾個方面入手：目的基因整合的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化體中目的基因拷貝數(shù)、連續(xù)三代以上的分離情況(Southern,PCR)。目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化體在不同世代中目的基因的表達(dá)情況，即轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的穩(wěn)定性，需提供不少于三代的試驗(yàn)數(shù)據(jù)(Northern,

Western,

RT-PCR)。目標(biāo)性狀表達(dá)的穩(wěn)定性目標(biāo)性狀在轉(zhuǎn)化體不同世代中的表現(xiàn)，需提供不少于三代的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。重組載體的安全性：能否向自然界中不含該目的基因的生物轉(zhuǎn)移。第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日三、獸用基因重組活疫苗的安全性基因工程重組活疫苗是利用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因轉(zhuǎn)移到載體（病毒、細(xì)菌）中使之表達(dá)的活疫苗。根據(jù)其載體的致病性有兩個制備途徑。非致病性載體攜帶異源抗原基因，產(chǎn)生新的免疫。致病性載體通過基因修飾或突變使致病性大為減弱或消失，但仍保持免疫原性。基因重組活疫苗可分為：基因缺失疫苗與基因突變疫苗、復(fù)制性活載體疫苗、非復(fù)制性活載體疫苗三類。它們之間分別具有各自的特點(diǎn)，在安全性方面的表現(xiàn)也不盡相同。第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日1不同類型的基因重組活疫苗基因缺失疫苗與基因突變活疫苗：屬減毒或弱毒疫苗，正常使用不引起臨床疾病，但可誘發(fā)產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，對免疫力弱的人可能致病。復(fù)制性活載體疫苗：在接種的動物體內(nèi)特定免疫基因可隨載體生物復(fù)制和適量表達(dá)，產(chǎn)生抗體。非復(fù)制性活載體疫苗：不能在動物體內(nèi)復(fù)制，但特定免疫基因可少量表達(dá)而引起免疫反應(yīng)?；钶d體疫苗的優(yōu)點(diǎn)：可同時啟動細(xì)胞免疫和體液免疫、可構(gòu)建多價疫苗、用量少且持續(xù)時間長、不影響相關(guān)疾病監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查?；钶d體疫苗的缺點(diǎn)：與野生載體生物發(fā)生基因重組的可能性、進(jìn)化成新毒株的可能性、二次免疫的排斥反應(yīng)、殘存毒力問題。第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日2獸用基因工程活疫苗的安全性問題對人和動物健康的危害：致病性（包括毒性、致癌、致畸、致突變、致過敏等），抗藥性即轉(zhuǎn)基因微生物的抗藥性，食品安全性即接種疫苗后動物性食品是否食用安全的問題。對生態(tài)環(huán)境的潛在危害

致病性和毒性：與供體微生物和受體微生物相比

其致病性和毒性是否增加。

生存競爭力：與非轉(zhuǎn)基因微生物相比是否增強(qiáng)。

傳播擴(kuò)散能力：通過水、土、氣、動植物等遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的能力

遺傳變異能力：遺傳穩(wěn)定性與適應(yīng)性變異、突變率

遺傳轉(zhuǎn)移能力：向非轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)生遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日四、獸用的DNA疫苗的安全性DNA疫苗是將免疫應(yīng)答目的基因插入質(zhì)粒載體而制備的生物制劑。將其導(dǎo)入動物體后通過宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原，進(jìn)而誘生保護(hù)性免疫應(yīng)答。1.DNA疫苗簡介DNA疫苗的給藥途徑包括：注射、液噴、基因槍、口服和皮內(nèi)接種等。DNA疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)如下：

載體結(jié)構(gòu)簡單，分子克隆較易；

重組DNA分子穩(wěn)定，可制成凍干疫苗，便于貯運(yùn)

比傳統(tǒng)疫苗更安全，使用過程中不需用佐劑。將幾種重組質(zhì)粒簡單組合便可制備成多價疫苗。第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日2

DNA疫苗的安全性問題對DNA疫苗的主要擔(dān)憂：重組DNA片段可能整合至宿主DNA而造成插入突變，進(jìn)而可能致癌或致?。浑m然目前發(fā)現(xiàn)整合危險性相當(dāng)?shù)?，但缺乏靈敏有效的監(jiān)測手段，難得獲得準(zhǔn)確和全面的數(shù)據(jù)。對DNA疫苗使用的安全性還有一系列問題需闡明：

動物體內(nèi)究竟是哪些細(xì)胞攝取DNA、在哪些細(xì)胞中表達(dá)、表達(dá)的持續(xù)期有多久？

DNA是否進(jìn)入細(xì)胞核、能否復(fù)制、是否能整合？

外源抗源長期表達(dá)能否導(dǎo)致有害的免疫病理反應(yīng)？

對DNA注射是否會導(dǎo)致產(chǎn)生對DNA的抗體？或引起自身免疫反應(yīng)？第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日減毒菌的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品：

主要是活疫苗產(chǎn)品，通過轉(zhuǎn)基因減毒菌的培養(yǎng)、收集培養(yǎng)物或離心收集菌體、加入保護(hù)劑后轉(zhuǎn)入西林瓶、制備液體疫苗或凍干疫苗

要求生產(chǎn)過程嚴(yán)格GMP要求組織生產(chǎn)；

要求產(chǎn)品穩(wěn)定性好、加入的保護(hù)劑安全有效，且沒有引入有害物質(zhì)；要求生產(chǎn)和加工活動對轉(zhuǎn)基因生物的影響類型為類型2；

因此，轉(zhuǎn)基因活菌產(chǎn)品的安全性等同于轉(zhuǎn)基因的減毒菌株。

第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)獸用基因工程生物制品安全性評價一、危害性分類標(biāo)準(zhǔn)和安全性評價標(biāo)準(zhǔn)1.

危害性分類標(biāo)準(zhǔn)第一類危害性：個體和群體危害性低，不可能引

起健康動物疾??；第二類危害性：中度個體危害、有限群體危害，

可能引起動物疾病，正常情況下不會對人

造成嚴(yán)重危害，具備有效治療和預(yù)防措施第三類危害性：高度個體危害、低度群體危害，

能引起嚴(yán)重的人或動物疾病，但不會引起

個體間傳播，有預(yù)防和治療手段；第四類危害性：高度個體和群體危害，能致病且

不可預(yù)防或治療，可個體間及人畜間傳播。第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.安全性評價標(biāo)準(zhǔn)第一類制品的安全性評價：評價的重點(diǎn)是生物體的分子特性及受體生物基因和缺失或增加基因的特性。

分子特性：受體的特性、缺失的特性、供體基因的特性、重組體的特性、基礎(chǔ)種子的特性

生物學(xué)特性：包括受體、供體和基礎(chǔ)種子的生物

學(xué)特性、安全等級及其檢測方法●

第二類制品的安全性評價：評價的重點(diǎn)是缺失基因、疫苗生物和受體生物的分子特性和生物學(xué)特性。

分子特性：受體的特性、缺失的特性、基因缺失體

的特性、基礎(chǔ)種子的分子特性；

生物學(xué)特性：包括受體和基礎(chǔ)種子的生物學(xué)特性、