真核基因組中重復(fù)序列

基因組小，單拷貝；非編碼序列較少化學(xué)組成多樣；多順反子；基因重疊

斷裂基因；分段基因組

核基因組之一病毒基因組核基因組之二原核生物基因組1.基本是單拷貝的；2.擬核（類核）結(jié)構(gòu)；3.存在多順反子結(jié)構(gòu)；4.非編碼序列相對(duì)較少；

真核生物核基因組1.基因組較大，低等真核生物：107-108bp,較原核生物大10倍；高等真核生物：5X108-1010bp，某些植物和兩棲生物可達(dá)1011bp；哺乳類生物大于2X109它們可編碼100萬個(gè)基因。2.真核生物核DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核小體，再纏繞成染色質(zhì)（染色體）；重樓百合1.5X10e11

NucleosomestructureNucleosomecore(left)146bpDNA;13/4turnsofDNADNAisnegativelysupercoiledtwoeach:H2A,H2B,H3,H4(histoneoctomer)Nucleosome(right)~200bpDNA;2turnsofDNAplusspaceralsoincludesH1histoneNucleofilamentstructureVideoDNA包裝人體DNA的總長(zhǎng)度大約為3.5米，細(xì)胞核直徑僅有0.01毫米。按比例放大，相當(dāng)于將150公里的長(zhǎng)繩硬塞進(jìn)一個(gè)足球里。Wapl控制cohesin與DNA結(jié)合緊密程度。Vermicelli（意，小蟲子）骨架，維持染色體的形狀。

AntonioTedeschi,etal.Waplisanessentialregulatorofchromatinstructureandchromosomesegregation.Nature,25August2013;doi:10.1038/nature124713.基因組一般為雙倍體（diploid）;4.基因組中非編碼序列多于編碼序列，有大量的冗余DNA；5.存在大量重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可高達(dá)百萬倍；6.基因?yàn)閱雾樂醋印Ｒ粋€(gè)基因單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，一個(gè)基因一條mRNA,翻譯成一條多肽鏈；7.大部分基因有內(nèi)含子，因此基因不連續(xù)；8.具有基因家族。

真核生物基因組的特點(diǎn)：

重復(fù)性、基因家族、不連續(xù)性。

5’3’promoterregionexons(filledandunfilledboxedregions)introns(betweenexons)transcribedregiontranslatedregionmRNAstructure+1Genestructure（一個(gè)完整的具有轉(zhuǎn)錄功能的單元）不連續(xù)性

基因家族genefamily1.概念

基因組中來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的一組基因成為基因家族（genefamily）。一些基因彼此靠近，成串地排列在一起，這種基因排列結(jié)構(gòu)叫基因簇（genecluster）。在基因家族結(jié)構(gòu)中經(jīng)常會(huì)看到基因簇結(jié)構(gòu)。基因簇——多順反子結(jié)構(gòu)

分類：串聯(lián)重復(fù)多基因家族組蛋白、tRNArRNA分散重復(fù)多基因家族Alu家族不同組織、細(xì)胞類型、發(fā)育時(shí)期表達(dá)的多基因家族同工酶（珠蛋白）真核生物中重要的基因家族1.Alu基因家族分散重復(fù)序列在單倍體人基因組中有5X105個(gè)拷貝，約占人基因組的3-6%。每個(gè)重復(fù)單元的長(zhǎng)度為300bp,含一個(gè)Alu酶切位點(diǎn)，因而得名。酶切后生成130bp和170bp兩個(gè)片段，每個(gè)Alu片段兩側(cè)有6-20bp的同向重復(fù)序列，存在于間隔區(qū)（space）和內(nèi)含子中。功能：可能與基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控、加工有關(guān)。LDLreceptorgeneAlurepeatspresentwithinintronsAlurepeatsinexons444555666AluAluAluAluX46Aluunequalcrossingoveroneproducthasadeletedexon5(theotherproductisnotshown)

2.rRNA基因家族串聯(lián)重復(fù)，有轉(zhuǎn)錄活性

大多數(shù)真核生物rRNA基因家族集中分布在一條或幾條染色體上，以核仁區(qū)含量最高。通常編碼區(qū)較為保守，內(nèi)間區(qū)具有種間特異性，常被用作物種種類鑒定及進(jìn)化分析。

rRNA基因家族（genecluster）

5SrRNA基因家族在所有染色體上都有，分布頻率較高。一般由120bp組成每個(gè)重復(fù)單元由5sRNA基因和和轉(zhuǎn)錄區(qū)前的非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成，重復(fù)串聯(lián)形成基因簇。非洲爪蟾卵母細(xì)胞的5sRNA基因：富含A-T的序列，由不同的15bp序列重復(fù)而成，（CAAAGTTTGAGTTTT）這段序列的串連數(shù)不同，非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)的長(zhǎng)度會(huì)有所改變。

真核生物tRNA基因家族

tRNA基因長(zhǎng)約70-90bp,基因全長(zhǎng)約140bp；基因之間串聯(lián)重復(fù)排列；多個(gè)不同的tRNA基因組成一個(gè)串聯(lián)重復(fù)，每個(gè)基因的方向不同，并單獨(dú)轉(zhuǎn)錄。組蛋白基因家族與細(xì)胞DNA復(fù)制有關(guān)中度重復(fù)序列（幾十~幾百個(gè)重復(fù)），不含內(nèi)含子，無需轉(zhuǎn)錄后加工，mRNA產(chǎn)物無3’—polyA與DNA復(fù)制無關(guān)的組蛋白組織特異性表達(dá)的組蛋白單拷貝

特點(diǎn)：組蛋白基因缺乏內(nèi)含子；組蛋白基因家族是重復(fù)序列中唯一已知具有蛋白質(zhì)編碼功能的基因。珠蛋白基因家族血紅蛋白分子是珠蛋白的四聚體22，型亞基基因在16號(hào)染色體上，型亞基基因在11號(hào)染色體上，珠蛋白基因以基因家族的形式排列。核基因組之三真核生物核基因組1.一般為雙倍體,基因組較大，2.真核生物核DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核小體，再纏繞成染色質(zhì)（染色體）；3.基因?yàn)閱雾樂醋?有內(nèi)含子不連續(xù)；4.基因組中非編碼序列多，存在大量重復(fù)序列；5.基因家族基因組結(jié)構(gòu)與進(jìn)化的關(guān)系：1.基因組的物質(zhì)組成從多樣→單一；DNA、RNA分工明確單鏈、雙鏈，線狀、環(huán)狀→雙鏈線狀2.基因組由小→大；3.DNA的利用率越來越低；（多拷貝、非編碼區(qū)、基因不連續(xù)）4.調(diào)控序列增多，調(diào)控方式更復(fù)雜。PropertiesofthehumangenomeNuclearthehaploidhumangenomehas~3X109bpofDNAsingle-copyDNAcomprises~75%ofthehumangenomethehumangenomecontains~23,000to25,000genesgenesarecomposedoffrom1to>75exonsgenesvaryinlengthfrom<100to>2,300,000bpAlusequencesarepresentthroughoutthegenomeMitochondrialcirculargenomeof~17,000bpcontains<40genes遺傳性疾病----DMD

遺傳性疾病----DMD的分子診斷迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，發(fā)病率為1/3500個(gè)男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長(zhǎng)2400Kb,有79個(gè)外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin缺陷檢測(cè)DMD基因的技術(shù)：Southern印跡、多重PCRDMD基因外顯子缺失的檢測(cè)

史蒂芬·霍金

ALS肌萎縮性側(cè)索硬化癥

TypeofDNA%ofGenomeFeaturesSingle-copy(unique) ~75% Includesmostgenes1RepetitiveInterspersed ~15% Interspersedthroughoutgenomebetween andwithingenes;includesAlusequences2

Satellite(tandem) ~10% Highlyrepeated,VNTRs

2

Alusequencesare about300bpinlength andarerepeatedabout 300,000timesinthe genome.Theycanbe foundadjacenttoor withingenesinintrons ornontranslatedregions.1Somegenesarerepeated,wouldbeintherepetitiveDNAfraction501000IIIIIIIIIfast~10%intermediate

~15%slow(single-copy)

~75%ClassesofrepetitiveDNAInterspersed(dispersed)repeats(e.g.,Alusequences)TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTandemrepeats(e.g.,microsatellites)GCTGAGGGCTGAGGGCTGAGG

重復(fù)性（重復(fù)序列）DNA的復(fù)雜性Cot1/2=1/k

據(jù)基因組重復(fù)次數(shù)高低：?jiǎn)慰截愋蛄兄貜?fù)序列輕度重復(fù)序列2~101中度重復(fù)序列10~102高度重復(fù)序列102~106

1.單拷貝序列：只有一個(gè)拷貝，占基因組的40-70%.主要是功能基因。2%2.輕度重復(fù)基因組中有2-10個(gè)拷貝,主要是組蛋白和tRNA基因.

3.中度重復(fù)序列

拷貝數(shù)有幾十至幾百個(gè)，一般無RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（非編碼序列）,一般認(rèn)為與基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)(包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，復(fù)制控制序列，轉(zhuǎn)錄后的加工等).

長(zhǎng)周期分散的重復(fù)序列LINE5000bp疾病分兩種短周期分散的重復(fù)序列SINE100~300bp

4.高度重復(fù)序列

衛(wèi)星：（satelliteDNA）序列較短5-100bp，大部分集中在異染色質(zhì)中（中心粒和端粒的附近）真核生物中含10~20%。特點(diǎn)：A、T含量高，序列簡(jiǎn)單，不轉(zhuǎn)錄，其功能尚不清楚。小衛(wèi)星:15-70核心序列為33bp，常定位在人常染色體區(qū)域，呈多態(tài)性微衛(wèi)星(microsatellite)。微衛(wèi)星在2～6bp之間，普遍散布在人類整條染色體上，或者在基因間區(qū)域或者位于內(nèi)含子內(nèi)。又稱簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列STR，SSR（SimpleSequenceRepeats）DNAdetective分子探針1.RFLP2.SSR/STR3.SNP應(yīng)用：正常樣本的差異鑒定病理樣本的變化1982年，Bell等發(fā)現(xiàn)高度串聯(lián)重復(fù)的短序列單位，重復(fù)單位數(shù)目的差異導(dǎo)致了這種高度的可變性，由于這些結(jié)構(gòu)特征，人們稱這些區(qū)域可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)。

VNTR1985年，Jeffreys等用肌紅蛋白基因第一內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列(重復(fù)單位含33bp)作探針,從人的基因文庫(kù)中篩選出8個(gè)含有串聯(lián)復(fù)序列(小衛(wèi)星)的重組克隆。序列分析表明，這8個(gè)小衛(wèi)星重復(fù)單位的長(zhǎng)度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列(coresequence)。他們先后用兩個(gè)多核心小衛(wèi)星探針進(jìn)行southern雜交，在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到了包含10多條帶的雜交圖譜，不同個(gè)體雜交圖譜上帶的位置就象人的指紋一樣千差萬別，Jeffrey稱之為DNA指紋(DNAfingerprint)，又名遺傳指紋(geneticfingerprint)。(VNTR)analysisiscommonlyusedinforensicsVNTRisbasedonhypervariablemicrosatellitesequencepolymorphismswithinthehumangenome.Thesesequences(e.g.,CACACA…)arefoundinmanylocationsinthehumangenomeandvarygreatlyfrompersontoperson.UsingVNTRtocompareforensicandsuspectsamplesIndividualsA&Careexcludedbythisanalysis.ThesamplesfromindividualBwillbesubjectedtofurthertests.微衛(wèi)星MicrosatelliteDNA

SSR（SimpleSequenceRepeats）

微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡(jiǎn)單重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單元的長(zhǎng)度在2—10bp之間，常見的微衛(wèi)星如(TG)n或(AAT)n等，呈現(xiàn)出長(zhǎng)度多態(tài)性(序列多態(tài)性)。而且每個(gè)SSR座位兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列.了解SSR座位的側(cè)翼序列(FlankingRegion)，尋找其中的特異保守區(qū)。據(jù)此可設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對(duì)遷移距離，便可知不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。微衛(wèi)星的優(yōu)點(diǎn)：（1）微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中。據(jù)估計(jì)，在基因組中平均30—50kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星，為在整個(gè)基因組中定位更多的基因提供了極大的方便（2）微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性(SSR重復(fù)數(shù)目變化很大，所以SSR標(biāo)記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性)，并且微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)可以顯示純合子和雜合子（孟德爾遺傳）。這就是SSR標(biāo)記的原理。（3）微衛(wèi)星檢測(cè)容易、重復(fù)性較好、省時(shí)，適合于進(jìn)行自動(dòng)化分析。通過GeneScan檢測(cè)，一個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)一般可在24h內(nèi)完成，且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的檢測(cè)。應(yīng)用CombinedDNAIndexSystem(CODIS)DNAdatabase(FBI)

DNAdetective應(yīng)用：1.生物進(jìn)化2.DNA指紋圖譜（親子鑒定）3.RFLP分析檢測(cè)基因缺失、突變、擴(kuò)增第一代RFLP限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析RestrictionFragmentLengthPolymorphisms制作方法：酶切—電泳—（轉(zhuǎn)膜—雜交）—分析

舉例：

——鐮刀狀紅細(xì)胞貧血

β－珠蛋白基因的第六個(gè)密碼子A→T↓

表達(dá)產(chǎn)物：谷氨酸→纈氨酸

一個(gè)堿基突變→缺失1個(gè)MstⅡ內(nèi)切酶位點(diǎn)

正常人：1.1kb患者：1.3kb

5’3’

5’3’

1.1kb

1.3kb

MstII酶切位點(diǎn)（CCTNATG）正常基因突變基因1.3kb1.1kb0.2kb123

1、正常人2、突變攜帶者3、患者AFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析制作方法：酶切—加接頭—PCR—電泳—分析。RFLP、AFLP用于突變分析的局限性：突變必須發(fā)生于酶切位點(diǎn)區(qū)域，否則檢測(cè)不到。SSCP—Singlestrandconformationpolymorphism單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

基本原理：?jiǎn)捂淒NA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同?；具^程是:①PCR擴(kuò)增靶DNA;②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性；③聚丙烯酰胺凝膠電泳;④顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.

局限性：只有突變位點(diǎn)影響其空間構(gòu)象才能被檢出來。檢出率：70%

第三代SNPSNP是SingleNucleotidePolymorph