基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)

基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)第一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日分子克隆工具酶及其應(yīng)用限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類(lèi)--用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測(cè)等。第二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)

限制性內(nèi)切核酸酶第三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

一

.限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

1.

細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

WernerArber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。

2.限制酶HindII的發(fā)現(xiàn)

H．O．Smith和Wilox于1970年首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。

3.SV40限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制

D.Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。

第四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日二

.限制修飾系統(tǒng)的種類(lèi)1.

I型：由三個(gè)基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.

II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨(dú)立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨(dú)立存在的。

上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。

第五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

三.限制性內(nèi)切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。

2.命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。例如：HindⅢ前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱(chēng)H.

influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

HindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)第六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日四．限制酶的特點(diǎn)

1.識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)

１）識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起

２）富含ＧＣ第七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

３）對(duì)稱(chēng)性—雙對(duì)稱(chēng)

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外５）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2.

末端種類(lèi)

１）３’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

PstI

5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’第八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補(bǔ)的粘性末端ａ）切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如：FokI

FokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識(shí)別簡(jiǎn)并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

第九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識(shí)別和酶切，但BamHI和BglII的識(shí)別機(jī)率只有1/16。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識(shí)別和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C

不同末端的連接特性:除第4種末端不能進(jìn)行不同DNA分子或同種DNA分子不同切點(diǎn)產(chǎn)生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。第十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日五.異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）

1.定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶

2.特點(diǎn)：1）識(shí)別相同順序

2）切割位點(diǎn)的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

限制酶的星反應(yīng)（staractivity）

1.

特點(diǎn):限制酶識(shí)別序列特異性降低

2.

發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件（見(jiàn)下頁(yè)）

3.

星反應(yīng)的利用和避免第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識(shí)別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；

5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無(wú)NaCl。

第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日七.其它特異性的內(nèi)切酶及其用途

1.λ末端酶（λterminase）：

5’-GGGCGGCGACCTN--3’

N--5’，出現(xiàn)的頻率約412

分子量為117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）

2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418=6.9X1010bp，其識(shí)別順序?yàn)?/p>

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT

3.I-PpoI：來(lái)自于Physarumpolycephalum

識(shí)別序列：CTCTCTTAAGGTAGC

AATT

4.用途遺傳標(biāo)記，構(gòu)建載體第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日八.限制酶的用途

1.

DNA重組

2.

限制酶（物理）圖譜繪制

3.

突變分析（RFLP分析）

4.限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點(diǎn)

1.

具有特異型核苷酸順序識(shí)別能力，但該順序不具有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。

2.

酶切位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)不一致，切點(diǎn)常在識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)，1--20nt。

3.

酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。

4.

產(chǎn)生粘性末端可以是1--5個(gè)核苷酸。

5.

均為單體，分子量為47—108kD。第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

第二節(jié)

DNA甲基化酶

第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一.甲基化酶的種類(lèi)與識(shí)別順序

1.

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。如：M.EcoRI

GAmATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG

相同第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

2.E．coli

的dam、dcm甲基化酶

這類(lèi)甲基化酶與限制酶無(wú)關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限制修飾系統(tǒng)。

dam

G

mATC，dcm

CmCA/TGG

3.哺乳動(dòng)物的甲基化酶

該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程有關(guān)。

4.E．coli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日二.甲基化酶活性對(duì)限制酶活性的影響

1.dcm和dam甲基化酶對(duì)限制酶的影響

1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識(shí)別順序是完全重疊還是邊界重疊如：完全重疊BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG)

邊界重疊ClaI--dam；Sau96I--dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識(shí)別順序?yàn)楹畏N重疊如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm--BstNI第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日表2對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶限制酶識(shí)別序列*甲基化酶AvaⅡGG(A/T)CC(A/T)GG

dcmBclⅠTGATCAdamClaⅠGATCGATdamEcoRⅡCC(A/T)GG

dcmHphⅠGGTGATCdamMboⅠGATCdamNruⅠGATCGCGAdamSau96ⅠGGNCC(A/T)GG

dcmSauFⅠCC(A/T)GG

dcmStuⅠAGGCCTGG

dcmTagⅠGATCGAdamXbaⅠTCTAGATCdam*下橫線字母表示限制酶識(shí)別序列,綠色字母表示dam甲基化酶識(shí)別序列,紅色字母表示dcm甲基化酶識(shí)別序列第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

2.

II型甲基化酶對(duì)限制酶活性的影響

１）

抑制同種限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)

２）

抑制不同種限制酶的活性

a.順序完全重疊如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）

b.順序邊界重疊如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同種限制酶的部分活性

M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改變某些限制酶識(shí)別順序的特異性，以便重組體的形成２）

在建立基因文庫(kù)時(shí)，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日表3甲基化酶與識(shí)別序列甲基化酶識(shí)別序列a受甲基化影響的限制酶bM.AluⅠAGmCTAluⅠ,BamHⅡ,Bsp1286

DdeⅠ,HgiAⅠ,NheⅠ,PstⅠM.BamHⅠGGATmCCBamHⅠ,MspⅠM.ClaⅠATCGmATClaⅠ,MboⅠ,TaqⅠdamGmATCc

dcmCCA/TGGc

M.EcoRⅠGAmATTCEcoRⅠM.HIdGCNGCGGmCCMstⅠ,PstⅠ,PvuⅡM.HaeⅢGGmCCBanⅡ,BglⅠ,Bsp1286,BstXⅠ,HaeⅢ,

MspⅠ,NaeⅠ,NcoⅠ,SacⅡ,Sau96ⅠM.HhaⅠGmCGCAhaⅡ,FnuDⅡ,HhaⅠM.HpaⅡCmCGGAhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠM.HphⅠTmCACCHinfⅠ,HphⅠ,Sau3AⅠM.MspⅠmCCGGBamHⅠ,MspⅠM.PstⅠCTGCmAGAluⅠ,PstⅠM.TaqⅠTCGmAAluI,AvaⅠ,EcoRV,HinCⅡ,HinfⅠ,

MboⅠ,TaqⅠ,XmnⅠa.標(biāo)在堿基的左上角的m表示該堿基被甲基化;b.所列出的限制酶均已商品化;c.參見(jiàn)表分離自噬菌體污染的細(xì)菌細(xì)胞，它可識(shí)別兩個(gè)序列，GCNGC的甲基化位點(diǎn)尚未確定。第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫(kù)的建立用于cDNA的連接RERERE第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)核酸酶

第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一.外切酶III（ExoIII）

1.一般特點(diǎn)：

來(lái)自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反應(yīng)類(lèi)型

1)外切酶活性：3’5’，產(chǎn)生5’-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的ds-DNA，2)核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，3)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，4)內(nèi)切酶活性：在無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶處將DNA鍵切開(kāi)，pH7.6-8.5第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

3.

外切酶活性特點(diǎn)

1)反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA2)堿基釋放速度：C>>A-T>>G3)反應(yīng)產(chǎn)物：5’-單磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，過(guò)度反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）標(biāo)記

2)

基因突變----缺失

3)

DNA序列測(cè)定時(shí)作順序缺失

5.

使用注意事項(xiàng)

1)

正式使用前，測(cè)定在一定條件下酶的反應(yīng)速度

2)

在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)(來(lái)自于cDNA加尾)第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標(biāo)記第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日二.λ外切酶

1.反應(yīng)特點(diǎn)

1)作用底物:要求5’-PO4基;不作用含切口的DNA分子

2)作用方向與產(chǎn)物：5’3’;產(chǎn)生5’-P核苷和3’-突起的ds-DNA

2.用途：DNA定序測(cè)定;除去5’-端突起，產(chǎn)生3’-端突起，便于加尾3’HO

3’HO

3’HO

OH3’

OH3’

OH3’

5’P

5’P

5’P

P5’

P5’

P5’

AAAAAAAAAAAATdT+dATP第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日三.核酸酶Bal31

1.

一般特點(diǎn)：胞外酶；具DNase和RNase活性；由“快”和“慢”兩種成分構(gòu)成

2.

催化反應(yīng)特點(diǎn)

1)底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切與內(nèi)切活性)2)作用方向與產(chǎn)物：5’3’和3’5’同時(shí)進(jìn)行，但反應(yīng)速度不同；產(chǎn)生5’-單磷酸核苷和縮短的ds-DNA

3.

用途：

基因突變--缺失;繪制限制酶譜;DNA定序(與ExoIII相同)，其優(yōu)點(diǎn)是Bal31酶活依賴于Ca++和Mg++，Ca++在反應(yīng)完畢后可用EGTA（乙二醇四乙酸）滅活而不影響Mg++濃度，后者是限制酶活性必需的

4.

使用注意事項(xiàng)：

1)應(yīng)作預(yù)備實(shí)驗(yàn)，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同

2)DNA兩條鏈堿基組成不同，終止反應(yīng)時(shí)存在單鏈突起，需要補(bǔ)平第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日5'PP5'3'HOOH3'核酸酶Bal31的活性第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日四.核酸酶S1

1.

一般特點(diǎn)：糖蛋白(含糖量8%)，最佳pH4.5，對(duì)熱穩(wěn)定，抗變性劑

2.

催化反應(yīng)類(lèi)型:

ss-DNA;ss-RNA;雙螺旋變性區(qū)

3.

用途

1)基因突變--缺失，常與外切酶，如ExoIII、λ外切酶、Bal31連用

2)DNA定序分析

3)S1作圖法

4)基因結(jié)構(gòu)分析

5)tRNA結(jié)構(gòu)分析

4.

使用注意事項(xiàng)

1)避免長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，因最適酸性pH將導(dǎo)致DNA斷裂或降解

2)避免使用高濃度酶量，以免DNA被降解(因產(chǎn)生切口)第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)5'5'5'5'5'5'核酸酶S1活性

第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

五.綠豆核酸酶

1.

與S1酶相同點(diǎn)：作用于ss-DNA和RNA，對(duì)5’-端的突起核苷酸作用速度為GC>>AT

2.

與S1酶的不同點(diǎn)

最適pH接近中性，不會(huì)產(chǎn)生切口;不使具切口的ds-DNA斷裂

3.用途：與S1酶相同六.外切酶Ⅶ

作用于ss-DNA的3’-與5’-端，產(chǎn)物為低聚核苷酸除去單鏈DNA形成平整末端

七.牛脾磷酸二酯酶

作用含5’-羥基端的ss-DNA和RNA，產(chǎn)生3’-單磷酸核苷用于短鏈RNA和DNA的定序分析第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

八.蛇毒磷酸二酯酶

作用3’-羥基單、雙鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5’-單磷酸核苷用于RNA和DNA的定序分析表4幾種常用外切酶的特點(diǎn)外切酶作用方向作用底物反應(yīng)產(chǎn)物

ExoIII3’→5’dsDNA單核苷酸

λ外切酶5’→3’ss和dsDNA同上

Bal313’→5’和5’→3’ss和dsDNA,RNA同上

S13’→5’和5’→3’ssRNA和ssDNA低、核苷酸綠豆核酸酶3’→5’和5’→3’ssRNA和ssDNA同上

ExoVII3’→5’和5’→3’ssDNA低聚核苷酸牛脾磷酸二酯酶5’→3’ssRNA，ssDNA同上蛇毒磷酸二酯酶3’→5’ss，dsRNA和DNA同上第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

九.RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。RNase的識(shí)別序列和特點(diǎn)見(jiàn)表5。

1.RNaseA分離自牛胰臟，對(duì)熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦稱(chēng)微球菌核酸酶，對(duì)RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA

十.RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫(kù)建立時(shí)除去DNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

表5核糖核酸酶反應(yīng)特點(diǎn)核酸酶特異性反應(yīng)核酸酶特異性反應(yīng)

APyp/NPhyMAp/N或Up/NCL3Cp/N,Ap/N和Cp/N

B.cereusCp/N,Up/NT1Gp/NP1無(wú)特異性反應(yīng)

T2無(wú)特異性反應(yīng)S7Np/A和Np/UU2Pup/N或Ap/NPhy1Ap/N,Gp/N和Up/N第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

十一.DNaseI

1.特點(diǎn)：具內(nèi)切酶活性，作用于ds-DNA，但無(wú)核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+

或Ca2+,Mn2+可使酶活達(dá)最大值當(dāng)酶濃度很低時(shí)，ds-DNA分子上將形成切口，不同類(lèi)型二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口獨(dú)立無(wú)關(guān)Mn2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制備DNA探針

2)制備RNA樣品時(shí)除去DNA分子

3)基因突變時(shí)產(chǎn)生切口

第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

Mn++存在時(shí)

Mg++存在時(shí)

DNaseI作用特點(diǎn)DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolI第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)

DNA聚合酶

第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

一

.E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli

的DNA聚合酶系統(tǒng)

PolI參與DNA修復(fù),具3’→5’和5’→3’外切酶活性

polII同上具3’→5’外切酶活性

polIII參與DNA復(fù)制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特點(diǎn)

1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱(chēng)為Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響（表6）

3）外切酶活性

第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

3.用途

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無(wú)dNTP時(shí)）

2）補(bǔ)齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段表6E.coliDNAPolI的延續(xù)性

DNA模板-引物類(lèi)型反應(yīng)條件延續(xù)性(堿基數(shù))

切口ColE137°C,低鹽8

缺口ColE137°C,低鹽47

切口/缺口胸腺DNA37°C,低鹽24polyd(AT)37°C,低鹽188polyd(AT)5°C,低鹽14polyd(AT)5°C,高鹽3第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

二.T4DNA聚合酶

1.特點(diǎn)：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min

2.

用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失5’CAGCAACGT

3’dATPCAGCAACGT3’S1T3’3’GTCGTTGCA5’T4聚合酶

A5’A5’

外切酶活性

聚合酶活性

無(wú)dNTPdNTP第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日三.反轉(zhuǎn)錄酶

1.AMV反轉(zhuǎn)錄酶

1）結(jié)構(gòu)與酶活性反轉(zhuǎn)錄酶以α，αβ，ββ形式存在，其中β（無(wú)活性）→P32（內(nèi)切酶活性）+α→聚合酶+P24（RNaseH活性），各步反應(yīng)由蛋白酶催化

2）聚合酶活性

a.RNA，DNA引物（大于8nt）→cDNA鏈

b．DNA-RNA引物→互補(bǔ)DNA鏈

c．(rA)1100→(dT)12-18→(dT)nor(rc)n..dGn→(dG)n第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)和活性

ββαβαP24

190kD160kD65kD24kD

P32

RNaseH

聚合酶

5’AAAAA3’引物

5’AAAAA3’

TTTTT5’

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

5’3’5’3’3’5’3’5’

全長(zhǎng)cDNA提前終止反應(yīng)

第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日2.M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶

1)特點(diǎn)：

不具內(nèi)切酶活性;RNaseH活性低;穩(wěn)定性差

2)與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較

a．合成短鏈cDNA(0.6kb)時(shí)，兩者相同，但M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān)

b．合成長(zhǎng)鏈cDNA(4.5-7.5kb)時(shí)，它比AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多，這與它無(wú)內(nèi)切酶活性有關(guān)。

3)用途

a.cDNA合成用于文庫(kù)建立;b.制備cDNA探針;c.DNA序列分析;d.填補(bǔ)5’-突起末端以獲平端第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日四.TaqDNA聚合酶

1.特點(diǎn)：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對(duì)95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性

2.用途：

主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個(gè)DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍

DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個(gè)步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→

引物延伸(75℃)

第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日TaqPol和PCR

5’3’變性

3’5’

5’3’引物

3’5’復(fù)性

5’3’5’3’

3’5’引物

3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

五.DNA定序酶

用基因工程方法去除3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶

六.TthDNA聚合酶

93kD，75℃，含有二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA分子的定序

七.TliDNA聚合酶

100℃仍具酶活，3’→5’外切酶活性，85kD

DNA的切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng)

DNA聚合酶和核酸酶S1或綠豆核酸酶連用,可用于DNA末端結(jié)構(gòu)的修飾第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日5’—AAGCTT—3’HindIII

5’—AAGCTT—3’3’—TTCGAA—5’3’—TTCGAA—5’

S1dNTP+klenowfrag

5’—AT—3’5’—AAGCTAGCTT—3’3’—TA—5’3’—TTCGATCGAA—5’

T4DNA連接酶T4DNA連接酶

5’—AT—3’5’—AAGCTAGCTT—3’

3’—TA—5’3’—TTCGATCGAA—5’切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng)

第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日四種不同補(bǔ)平反應(yīng)5’-GGATCC-3’BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’3’-CCTAGG-5’

dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5’-GGATC5’-GG5’-GGA5’-GGAT

3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAG

GATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’

CTAGG-5’GG-5’AGG-5’TAGG-5’

I

S1S1S15’-GG

CC-3’5’-GGA

TCC-3’5’-GGAT

ATCC-3’3’-CC

GG-5’3’-CCT

AGG-5’3’-CCTA

TAGG-5’

II

III

Ⅳ

第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)

RNA聚合酶

第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

一.SP6RNA聚合酶

1、特點(diǎn)：

依賴于DNA的RNA聚合酶，具SP6啟動(dòng)子特異型

2、用途：

主要用于RNA分子的體外合成，RNA分子可用于：

1）RNA分子的拼接研究

2）標(biāo)記的RNA常用于雜交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更穩(wěn)定，兩條鏈均可標(biāo)記，產(chǎn)生的RNA具高放射比活性

3）DNA的定序分析

4）基因結(jié)構(gòu)的研究，其中包括內(nèi)含子數(shù)目，長(zhǎng)度和位置

5）還可以用于蛋白質(zhì)的合成研究第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日RNA聚合酶活性

第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

二.T7RNA聚合酶特異性識(shí)別T7噬菌體基因啟動(dòng)子三.T3RNA聚合酶特異性識(shí)別T3噬菌體基因啟動(dòng)子基因啟動(dòng)子識(shí)別的特異性比較：SP6>T7>T3

四.E.coliRNA聚合酶五.多聚核苷酸磷酸化酶

第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第六節(jié)連接酶

第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一.T4DNA連接酶

1.特點(diǎn)：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的連接

2)平整末端的相連

DNA平端來(lái)源：限制酶作用結(jié)果;限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多

3.

抑制劑：

PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca++>0.1mM第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA連接酶

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’

或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA連接酶的連接反應(yīng)(兩種插入方向)

+第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日二.E.coliDNA連接酶

只能連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子三.T4RNA連接酶參與單鏈RNA分子的連接。主要用于提高T4DNA連接酶在連接反應(yīng)中的連接效率（20倍）

HOPHOPHOP5’3’5’3’5’3’

RNA連接酶活性

第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第七節(jié)

核酸末端修飾酶第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

一.細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）

1.

特點(diǎn)

1)除去ss-DNA，ds-DNA和RNA分子兩端的3’-和5’-磷酸基

2)對(duì)熱穩(wěn)定

2.

用途

1)載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率

2)核酸末端標(biāo)記二.牛小腸堿性磷酸酶（CIP）

與BAP相同，只是CIP對(duì)熱敏感第六十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

[γ-32P]ATPATP

5’POH3’5’

32P

OH3’3’HOP5’3’HO

32P

5’

I

II

5’POH3’5’HOOH3’5’

P

OH3’3’HOP5’3’HOOH5’3’HO

P

5’

磷酸酶(I)與磷酸激酶(II)活性

磷酸激酶的交換反應(yīng)第六十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日三.T4多聚核苷酸激酶

1.

催化反應(yīng)類(lèi)型

1)

激酶活性（5’-磷酸化酶）：可將ATP中的γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5’-羥基端，在這反應(yīng)過(guò)程中可有兩種方式進(jìn)行（pH7.5-8）

ⅰ.轉(zhuǎn)移反應(yīng)；ⅱ.交換反應(yīng)

2)3’-磷酸酶活性（pH5-6）

2.

用途

1)5’-端末端標(biāo)記

2)分子克隆過(guò)程中以獲得5’-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng)第六十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

四.末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）

1.

反應(yīng)特點(diǎn)

底物：dNTP及衍生物，>3個(gè)核苷酸，要求3’-OH端，需要ss-DNA作為引物，以3’-突起端的ds-DNA為最高，亦可用于ds-DNA加尾

2.核苷酸摻入速度

二甲基砷酸鹽緩沖液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸的摻