基因工程第七章重組子選擇篩選與分析

基因工程第七章重組子選擇篩選與分析第一頁，共四十頁，2022年，8月28日第七章重組子選擇、篩選和分析（TheSelection,screeningandanalysisofrecombinants）教學目的與要求：1)Geneticselectionandscreeningmethods2)Screeningclonebanksbynucleicacidhybridization（Southernblotting，Northernblotting）3)Immunologicalscreeningforexpressedgenes(Westernblotting)4)Analysisofclonedgenes(Restrictionmapping,DNAsequencing)2第二頁，共四十頁，2022年，8月28日第一節(jié)轉(zhuǎn)基因篩選和選擇的方法轉(zhuǎn)化子：將導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子被稱為重組子陽性克隆子：如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子?？寺∽拥暮Y選或選擇：經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選或選擇。第三頁，共四十頁，2022年，8月28日1．根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇遺傳標記基因，可進行轉(zhuǎn)化子或重組子初步篩選。做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液（包括對照處理）適量涂布在選擇培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，觀察菌落生長情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。對于受體細胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體DNA分子上攜帶的選擇標記基因所決定。

（1）抗藥性篩選法（2）插入失活篩選法（3）插入表達篩選法第四頁，共四十頁，2022年，8月28日（1）抗藥性篩選這是利用載體DNA分子上的抗藥性篩選標記進行篩選的方法。主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子篩選。重組質(zhì)粒DNA分子攜帶特定的抗藥性選擇標記基因，在含有相應(yīng)選擇藥物的選擇培養(yǎng)基上正常生長。①氨芐青霉素（ampicillin，Ap或Amp）:含bla基因的菌體能轉(zhuǎn)譯-丙酰胺酶(-lactarnase)，可降解Ap。②氯霉素(chloramphenicol,Cm或Cmp):含cat基因的菌體能轉(zhuǎn)譯氯霉素乙酰轉(zhuǎn)酰酶(chloramphenicolacetyltransferase)，使Cm乙?；А＂劭敲顾?kanamycin,Kn或Kan):含Kan抗性基因菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾Kn的酶，阻礙Kn對核糖體的干擾。四環(huán)素(tetracymic,Tc或Tet):含Tc抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能改變細菌膜的蛋白，防止Tc進入細胞后干擾細菌蛋白質(zhì)的合成。⑥鏈霉素(strentomycin,Sm或Str):含Str抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾Sm的酶，抑制Sm與核糖體結(jié)合。第五頁，共四十頁，2022年，8月28日（2）插入失活篩選法外源DNA片段插入載體DNA的BamHI位點，導致載體Tcr基因失活，重組子具有AprTcs的遺傳表型，而非重組子則為AprTcr，重組子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生長；非重組子卻在兩種平板上都能生長。

β-galactosidaseX-galIPTGblue-coloured第六頁，共四十頁，2022年，8月28日（3）插入表達篩選法插入表達法是利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。例如pTR262質(zhì)粒載體，其Tcr基因的上含有一段噬菌體DNA的CI阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列，CI基因表達的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表達。當外源DNA片斷插入CI基因的HindIII或BglI位點上時，CI基因失活，Tcr基因因阻礙解除而得以表達，故陽性重組子為Tcr表型，含有外源DNA插入片斷的陽性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。第七頁，共四十頁，2022年，8月28日2．利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞在植物轉(zhuǎn)基因研究中，載體攜帶的選擇標記基因（selectivegene）經(jīng)常稱為報告基因(reportorgene)，常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他特殊產(chǎn)物的基因等。（1）利用抗生素報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞①新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neomycinephosphotransferase-II,NPTII）基因新霉素(neomycin)與卡那霉素(kanamycin)、慶大霉素和G418等均屬于氨基環(huán)醇類的抗生素，它們的結(jié)構(gòu)相似，能抑制原核細胞核糖體70S起始復(fù)合物的形成，從而阻礙了蛋白質(zhì)的合成，進一步抑制了細胞的生長。NptII基因催化ATP上-磷酸基團轉(zhuǎn)移到上述抗生素分子的某些基團上，從而阻礙抗生素分子與靶位點的結(jié)合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物轉(zhuǎn)化材料僅有攜帶NptII基因的轉(zhuǎn)化植物細胞才能存活下來。

第八頁，共四十頁，2022年，8月28日②潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因某些植物細胞株系（如水稻）對卡那霉素具有一定的抗性，利用卡那霉素篩選NptII基因轉(zhuǎn)化體時假陽性率高，這時可采用Hpt報告基因進行篩選。潮霉素原是一種鏈霉菌的產(chǎn)物，通過與70S和50S核糖體的結(jié)合來抑制許多原核生物與真核生物的生長。HPT酶能催化ATP上的-磷酸基團轉(zhuǎn)移至潮霉素分子上而使之失活。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎重。③氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因氯霉素可選擇性地與原核細胞核糖體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶的活性，從而阻斷肽鍵的形成并最終抑制細胞生長。CAT基因催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)乙?；孤让顾厥Щ?。第九頁，共四十頁，2022年，8月28日（2）利用生化報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞①-葡萄糖酸苷酶（-Glucuronidase,GUS）基因作為一種水解酶，轉(zhuǎn)化植物細胞所產(chǎn)生的-葡萄糖酸苷酶能夠催化某些特殊反應(yīng)的進行，通過熒光、分光光度和組織化學的方法對這些特殊反應(yīng)產(chǎn)物的檢測即可確定Gus報告基因的表達情況，以此區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子。第十頁，共四十頁，2022年，8月28日②熒光素酶（luciferase,LUC）基因LUC是一種源于螢火蟲的動物蛋白基因產(chǎn)物，能夠催化生物發(fā)光反應(yīng)。1985年Luc基因首次被克隆。該酶在激活因子Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，同時發(fā)射光子。③冠癭堿（opine）合成酶基因冠癭堿合成酶基因主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成酶基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段。冠癭堿合成酶基因含有類似真核生物的啟動子和poly(A)序列，植物細胞中的表達產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離菲醌熒光染料染色，可以方便地觀察到反應(yīng)產(chǎn)物的生成。第十一頁，共四十頁，2022年，8月28日（3）利用抗除草劑基因篩選轉(zhuǎn)基因植物細胞Bar基因是1987年從水鏈霉菌中分離出來的，它編碼的PPT-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)能夠解除非選擇性除草劑的毒性。PPT是L-谷氨酸的類似物，能強烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺合成酶一旦受到抑制，將會導致植物體內(nèi)氨的迅速積累，并使植株死亡。Bar基因的表達產(chǎn)物PAT通過對PPT的乙?；瘡亩獬齈PT的毒性，可以使轉(zhuǎn)化植物細胞產(chǎn)生對除草劑的抗性。3．利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptII)基因也可作為遺傳選擇標記用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的篩選，除此以外，常用的標記基因還有：胸酰核苷激酶基因(tk)、二酸葉酶還原酶基因(dhfr)及細菌的黃呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecogpt)等第十二頁，共四十頁，2022年，8月28日4．營養(yǎng)缺陷型檢測法根據(jù)目的基因在受體細胞中表達產(chǎn)物的性質(zhì)，篩選含目的基因的克隆子。5．形成噬菌斑篩選法對于系統(tǒng)而言，外源DNA插入噬菌體載體后，重組DNA分子大小必須在野生型DNA長度的78%~105%范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，導入受菌體后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基平板上被裂解形成噬菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常生長，兩者很容易區(qū)分。取代型載體，則噬菌斑中的噬菌體即為重組子，產(chǎn)生噬菌斑。使用插入型載體，篩選重組子可以利用載體上的篩選標記基因，如lacZ’等。當外源DNA片段插入lacZ’基因內(nèi)時，重組子噬菌斑無色透明，而非重噬菌斑則呈藍色。第十三頁，共四十頁，2022年，8月28日小結(jié)：1．根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子（1）抗藥性篩選法（2）插入失活篩選法（3）插入表達篩選法2．利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（1）利用抗生素報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（2）利用生化報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞（3）利用抗除草劑基因篩選轉(zhuǎn)基因植物細胞3．利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞4．營養(yǎng)缺陷型檢測法5．形成噬菌斑篩選法第十四頁，共四十頁，2022年，8月28日第二節(jié)依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選法快速裂解菌落鑒定分子大小。根據(jù)有外源DNA片段插入的重組質(zhì)粒與載體DNA之間大小的差異來區(qū)分重組子和非重組子。

一、限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法從轉(zhuǎn)化菌落中隨機挑選出少數(shù)菌落，快速提取質(zhì)粒DNA，然后用限制性核酸內(nèi)切酶酶解，通過凝膠電泳分析來確定是否有外源基因插入及其插入方向等。第十五頁，共四十頁，2022年，8月28日二、利用PCR方法篩選確定重組子（Othergeneticselectionmethods：PCR）通過插入位點兩側(cè)已知序列互補的引物，以從初選出來的陽性克隆中提取的少量質(zhì)粒DNA為模板進行PCR反應(yīng)，通過對PCR產(chǎn)物的電泳分析就能確定是否是重組子菌落。

圖7-4轉(zhuǎn)基因植株中Gus基因的PCR檢測（PCRanalysisofGusinputativetransgenicplantlets），M,DNAmarker;P,以PCAM-Gus1質(zhì)粒為陽性對照;CK1,以水為模板的陰性對照;CK2,以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照;1-6，轉(zhuǎn)基因植株。第十六頁，共四十頁，2022年，8月28日Template:coloniesDenaturationat95℃60sPrimerannealingat55℃45s

Extensionat72℃120s1234√√√√1234Thermal

cyclerPCR37℃incubate5M12345√√23PrepareplasmidfornextanalysisUseofPCR第十七頁，共四十頁，2022年，8月28日第三節(jié)核酸分子雜交檢測法nucleicacidhybridization一、分子雜交定義與原理分子雜交（molecularhybridization）：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。

利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

第十八頁，共四十頁，2022年，8月28日核酸分子雜交操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標記核酸探針檢測雜交信號標記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標記探針第十九頁，共四十頁，2022年，8月28日

DNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC第二十頁，共四十頁，2022年，8月28日

Southernblotting（Southern印跡雜交法）Northernblotting（Northern印跡雜交法）Spotblothybridization(斑點雜交)colonyhybridization（菌落雜交）Nucleicacidhybridizationinsitu（原位雜交）DNAarray(DNA點陣)DNAchip(DNA芯片技術(shù))常用核酸雜交方法：第二十一頁，共四十頁，2022年，8月28日二、核酸雜交探針1.雜交探針：是指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補的核酸序列復(fù)性雜交，并可通過適當標記進行檢測。放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記的已知序列的核酸片段，即為探針。1）DNA探針優(yōu)點：探針多克隆在質(zhì)粒載體中，制備和使用方便。相對RNA探針，其不易降解。DNA探針標記方法較成熟，如缺口平移，隨機引物法等，同位素和非同位素標記。cDNA探針：cDNA（complementaryDNA）探針是指互補于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。cDNA探針是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。以反轉(zhuǎn)錄酶制備，應(yīng)用于高豐度mRNA的cDNA克隆篩選。第二十二頁，共四十頁，2022年，8月28日2）RNA探針RNA探針是一類很有前途的核酸探針，主要用于研究目的，而不是用于檢測。RNA是單鏈分子，它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。3)人工合成的寡核苷酸探針寡核苷酸探針的核苷酸序列是根據(jù)目的蛋白的一小段已知氨基酸序列推導合成出來的，長度一般為10~30bp，甚至可達50bp。要考慮遺傳密碼子的簡并性。用于基因組DNA文庫或cDNA文庫的篩選。第二十三頁，共四十頁，2022年，8月28日2.探針標記物1）放射性標記物常見的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等。2）非放射性標記物生物素（biotin）是一種水溶性維生素，又稱維生素H。分子經(jīng)化學修飾后可攜帶活性基因，能與核苷酸發(fā)生偶聯(lián)，使核苷酸具有生物素標記。標記的探針可通過生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)檢出，也可通過生物素-抗生物素抗體的免疫系統(tǒng)檢出。地高辛（digoxigenin，DIG）是一種類固醇類的半抗原，又稱為異羥基洋地黃毒苷配基，該配基通過一個由11個碳原子組成的接連臂與尿嘧啶相連，形成地高辛標記的尿嘧啶核苷酸。利用抗地高辛抗體上帶有的酶標記進行探針檢測。熒光素（fluorescein）是一類能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的物質(zhì)，包括異硫氰熒光素、羥基香豆素、羅達明等。熒光素與核苷酸結(jié)合即可作為探針標記物，主要用于原位雜交檢測。第二十四頁，共四十頁，2022年，8月28日3.Threemethodsforradiolabellingofnucleicacids1）EndlabellingDNA（末端標記法）UsingthepolynucleotidekinasetotransfertheterminalphosphategroupofATPonto5’-hydroxylterminiofnucleicacidmolecules.①

磷酸酶將5‘磷酸基團轉(zhuǎn)換成羥基②在PNK（多聚苷酸激酶）作用下，將ATP中的磷酸基團轉(zhuǎn)移到DNA分子的5’-OH位置。ATP中的γ的磷酸是用32P進行標記的OHOHHOHOOHOHHOPNKATP5’3’3’5’第二十五頁，共四十頁，2022年，8月28日2)LabellingDNAbyNicktranslation用低濃度的DNaseI.將DNA雙鏈切出切口

用DNApolymeraseI補平缺口3’5’5’3’▲NickSiteofNick3’5’5’3’▲DNApolI(a)Asingle-strandnickisintroducedintothephosphodiesterbackboneofaDNAfragmentusingDNaseI(b)DNApolymeraseIthensynthesisesacopyofthetemplatestrand,degradingthenon-templatestrandwithits5’-3’exonucleaseactivity.[α-32P]dNTPwereincorporatedintothenewlysynthesisedstrand.第二十六頁，共四十頁，2022年，8月28日3)Labellingnucleicacidsbyprimerextension

引物擴增法DNAisdenaturedbyheating3’5’5’3’3’5’3’5’5’HO3’5’5’DNApolI(Klenow)TheoligonucleotideprimersannealedtothesinglestrandDNAsTheKlenowfragmentofDNApolymerasesynthesiseacopyofthetemplate,primedfromthe3’-hydroxylgroupoftheoligonucleotide.IfalabelleddNTPissuppliedandisincorporated,theradiolabellingDNAwillbeproduced第二十七頁，共四十頁，2022年，8月28日三、SouthernblottingSouthern雜交是由E.Southern于1975年首先建立并使用的。（1）原理：是具有同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適當?shù)臏囟群碗x子強度等）按堿基互補原則退火形成特異性雙鏈。（2）基本步驟：質(zhì)?；蚧蚪MDNA酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用毛細管虹吸現(xiàn)象將變性DNA轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，再用32P標記的探針進行雜交。寡聚核苷酸用32P進行標記，用作探針使用，將探針和DNA在使用前退火，復(fù)性時，探針可以和單鏈DNA配對在x光下，放射自顯影找到配對的序列。

第二十八頁，共四十頁，2022年，8月28日Southernblotting

Digestwithrestrictedenzyme

Southern法可用于檢測特異的DNA序列片斷、基因定位等。

detect

hybridizationsignal

DNAextract第二十九頁，共四十頁，2022年，8月28日凝膠電泳（Gelelectrophoresis）原理：核酸帶有陰離子，在電泳緩沖液中，可向正極移動，移動速度與核酸大小相關(guān)，也與速度、單、雙鏈狀態(tài)相關(guān)。電泳儀用法：1）正、負極；2）電流大小；3）緩沖液；4）UV（紫外線）；5）注意EB第三十頁，共四十頁，2022年，8月28日

（其基本過程類似于上述Southern法）

提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)移至膜→探針（標記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA

四、Northernblotting

第三十一頁，共四十頁，2022年，8月28日基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上→用標記探針與之雜交→自顯影或顯色反應(yīng)→檢測雜交信號→分析結(jié)果。

五、斑點雜交優(yōu)點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少；缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性。

第三十二頁，共四十頁，2022年，8月28日六、菌落雜交該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。第三十三頁，共四十頁，2022年，8月28日七、原位雜交將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。