基因工程基本流程獲取目的基因

基因工程基本流程獲取目的基因第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日1獲取目的基因目的基因修飾、改良建立高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日2鳥槍法cDNA法PCR擴(kuò)增化學(xué)合成基因文庫第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日3鳥槍法（shotgun

）用基因組中的隨機(jī)產(chǎn)生的片段作為模板進(jìn)行克隆第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日4“鳥槍法”最初用于測(cè)定微生物基因組序列。近年來，美國塞萊拉公司利用改進(jìn)的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測(cè)序工作，證明了它在測(cè)定大基因組上的可行性和有效性。第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日5鳥槍法基本程序機(jī)械切割片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切

片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因組DNA片段的制備第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日6根據(jù)外源DNA片段的末端性質(zhì)、篩選方案和大小確定載體片段大小λ-噬菌體、YAC、BAC……篩選方案克隆載體：原位雜交或限制性酶切圖譜表達(dá)載體：基因產(chǎn)物功能檢測(cè)2.外源DNA片段的全克隆第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日7根據(jù)篩選方案確定受體：大腸桿菌：原位雜交或限制性酶切圖譜特異基因表達(dá)受體：基因產(chǎn)物功能檢測(cè)第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日8菌落原位雜交理想的探針是篩選的決定因素基因產(chǎn)物功能檢測(cè)依賴于篩選模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性限制性酶切圖譜

多次酶切篩選3.期望重組子的篩選第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日9限制性酶切圖譜第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日10例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將重組子用SalI切開，凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，回收DNA片段，根據(jù)目的基因內(nèi)部的特征性酶重復(fù)酶切過程直至篩選成功第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日11通過亞克隆在已克隆的片段上準(zhǔn)確定位目的基因，然后對(duì)目的基因進(jìn)行序列分析，搜尋其編碼序列以及可能存在的表達(dá)調(diào)控序列4.目的基因的定位第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日12鳥槍法操作的改進(jìn)-非隨機(jī)鳥槍法前提條件：目的基因的酶切圖譜已知目的基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)已知兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離已知如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日13鳥槍法的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)；不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日14cDNA法

cDNAmRNA的互補(bǔ)DNA(complementaryDNA)反/逆轉(zhuǎn)錄病毒基因復(fù)制和表達(dá)中間產(chǎn)物分離mRNA體外合成cDNA克隆進(jìn)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的重組克隆第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日151.mRNA的分離純化利用多數(shù)mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。含有poly(A)的mRNA親和層析低聚dT纖維素:用于poly(A)較長(zhǎng)的mRNA多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）無poly(A)的mRNA第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日162.雙鏈cDNA的體外合成反轉(zhuǎn)錄酶1）cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日17cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’2）cDNA第二鏈合成-自身合成第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日18核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日19第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日202）cDNA第二鏈合成-置換合成RNaseH識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日21mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日22第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日23第一鏈合成完畢后，變性去除殘留的mRNA，在cDNA的游離3’末端添加OligodC，然后與人工合成的OligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu)，聚合第二條鏈。3）cDNA第二鏈合成-引物合成第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日24mRNA3’5’AAAAAAAcDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’堿處理cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’dCTP末端轉(zhuǎn)移酶cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCC加入OligodG退火cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’AAAAAAA第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日25雙鏈cDNA的克隆克隆方案的選擇標(biāo)準(zhǔn)與鳥槍法相同末端性質(zhì)篩選方案片段大小第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日26cDNA重組克隆的篩選原位雜交產(chǎn)物功能檢測(cè)差示法（差別雜交/扣除雜交）第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日27在一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因正常表達(dá)，在另一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)。在這種情況下便可制備到兩種不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。通過這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫進(jìn)行篩選。當(dāng)使用存在目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)；而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片并對(duì)照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。差別雜交第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日28第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日29局限性差別雜交的靈敏度比較低，特別是對(duì)于那些低豐度的mRNA而言，這個(gè)缺點(diǎn)就顯得更加突出差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗費(fèi)時(shí)間和金錢

第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日30原理：羥基磷灰石柱結(jié)合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）扣除雜交第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日31從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日32AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BA第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日33PCR擴(kuò)增法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。TheNationalCenterforBiotechnologyInformation/NCBI

:EuropeanBioinformaticsInstitute/EMBL-EBI:DNADataBankofJapan/DDBJ:第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日341.直接從基因組中擴(kuò)增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增適合擴(kuò)增原核生物基因。第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日35原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日36（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2.從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR適合擴(kuò)增真核生物基因。第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日37目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日38化學(xué)合成法1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。化學(xué)合成目的基因的前提：核苷酸序列已知目前通用的合成方法：固相磷酸三酯合成法第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日39核苷酸1的3’-OH端在合成開始時(shí)就已經(jīng)附著在惰性的固相載體上，同時(shí)它的脫氧核糖環(huán)的5’-OH基團(tuán)也已用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護(hù)起來。這種固相載體典型的情況是使用可控微孔玻璃(CPG)。第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日40固相磷酸三酯合成過程結(jié)果是全保護(hù)的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對(duì)氯苯。最后脫保護(hù)。第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日合成的一個(gè)循環(huán)周期分為如下步驟：第一步，脫三苯甲基作用(detritylation)酸處理法，脫去與核苷酸1的5’-OH基團(tuán)偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)DMT。在這種脫DMT反應(yīng)中，常用的酸是二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)；第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日42第二步，偶聯(lián)反應(yīng)(coupling)。通過一種弱堿——四唑(tetrazole)的催化反應(yīng)，使加進(jìn)來的第二個(gè)核苷酸(N2)同已附著在固相載體上的核苷酸1之暴露的5’-OH基縮合；第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日43第三步，封端反應(yīng)(capping)。由加入的乙酸酐(aceticanhydride)激發(fā)乙酰化作用，把所有的沒有參與偶聯(lián)反應(yīng)的5’-OH基團(tuán)全都封閉起來；第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日44第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸N1和N2之間新形成的3’-5’亞磷酸三酯鍵十分活躍。利用碘液催化作用，使之被氧化成為相當(dāng)穩(wěn)定的3’-5’磷酸三酯鍵。這也就是為何我們稱這種寡核苷酸合成法為磷酸三酯法的原因。第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日45化學(xué)合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而絕大多基因的大小超過了這個(gè)范圍，因此，需要將寡核苷酸適當(dāng)連接組裝成完整的基因第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日46小片段黏接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成12-15bp的片斷，片段之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。因此DNA片段在退火時(shí)可以自動(dòng)排序，最后用T4連接酶連接即可得到完整基因?；瘜W(xué)合成DNA片斷的組裝第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日47T4DNA連接酶完整的DNA雙鏈退火第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日48優(yōu)點(diǎn)：DNA片段小，回收效率高缺點(diǎn)：互補(bǔ)序列短，退火時(shí)容易錯(cuò)配第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日49補(bǔ)丁延長(zhǎng)法目的基因的一條鏈分成若干40-50bp的片段，另一條鏈設(shè)計(jì)成與上述大片段交錯(cuò)互補(bǔ)的小片段（約20bp）DNA片段在退火用Klenow將空缺處補(bǔ)齊，最后用T4連接酶修復(fù)缺口。第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日50退火KlenowT4DNA連接酶第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日51大片段酶促法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日523’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日53將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為:基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary,含有全部基因）cDNA文庫（complementaryDNAlibrary,含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因文庫第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日54

基因組文庫的大小一個(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫的完整性第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日55例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日56cDNA文庫的大小一個(gè)cDNA文庫要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）N=ln(1-p)ln(1-)1n1n第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日57例如：人的成纖維細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)不到14個(gè)拷貝的低豐度mRNA約占整個(gè)mRNA含量的30%，這種mRNA大約11000種，因此1nn=11000/30%=37000=1/37000N=ln(1-0.99)ln(1-)137000=1.7×105包含完整人成纖維細(xì)胞cDNA信息的文庫需要17萬個(gè)克隆第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日58

文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力2.載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克隆3.克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利克隆排序4.克隆片段易于從載體分子上完整卸下5.重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第五十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日59制備原則：DNA片段之間存在部分重疊、大小均一（1）染色體DNA大片段的制備超聲波機(jī)械攪拌①物理切割法-平末端內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30