基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序第一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用

載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。

才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。1.2基因工程的基本操作程序第二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從已有物種中分離：如從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因第四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因1).基因文庫(kù)的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。

基因文庫(kù)的種類:基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)第五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日基因組文庫(kù)1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。受體菌群包含了這種生物所有的基因，該受體菌群稱為這種生物的基因組文庫(kù)。受體菌群包含了一種生物部分基因。部分基因文庫(kù)第六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2模板DNA；兩種引物；4種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；ATP等多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列原理：DNA復(fù)制條件：第七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日4PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板高溫解旋，_____斷裂，形成________b、復(fù)性（55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍，成指數(shù)形式擴(kuò)增（2n)。一第八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)的操作過程第九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP、適宜的溫度和PH四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP、適宜的溫度和PH、兩種引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等第十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日3.人工合成法在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法目的基因的mRNARNA-DNA雜交雙鏈雙鏈DNA(即目的基因)DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶第十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2基因表達(dá)載體的組成：目的：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等第十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日表達(dá)載體目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因啟動(dòng)子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：位于基因的尾端，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來第十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日①用__________切割目的基因和質(zhì)粒，使其生

。②

用__________將目的基因插入質(zhì)粒切口處，形成了一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。同種限制酶相同黏性末端DNA連接酶3.表達(dá)載體的構(gòu)建方法：不同受體細(xì)胞其構(gòu)建方法不完全相同第十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日注意：①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。第十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定（復(fù)制）和表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）的過程。2大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。轉(zhuǎn)化：常用的受體細(xì)胞：第十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（體細(xì)胞）的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：②原理：第十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞③過程：植物組織培養(yǎng)技術(shù)第十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞

例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（動(dòng)物受精卵）①方法：①程序?yàn)槭裁磳⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的受體細(xì)胞是受精卵？含目的基因的表達(dá)載體取動(dòng)物的受精卵含目的基因的受精卵轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯微注射發(fā)育顯微注射法第二十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)

細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合第二十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)第二十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA（目的基因）探針15N15N14N14N（1）導(dǎo)入檢測(cè)：是目的基因能否在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵?；蛱结槪河梅派湫酝凰貥?biāo)記的目的基因片段方法——DNA分子雜交技術(shù)(DNA與DNA)變性變性第二十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日DNA分子雜交示意圖若將兩種生物的DNA分子的單鏈能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雜合雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交；若不能堿基互補(bǔ)配對(duì)，仍然是兩條游離的單鏈。第二十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日第二十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（DNA與mRNA雜交）（2）轉(zhuǎn)錄檢測(cè)（目的基因）探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N第二十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日與相應(yīng)抗體雜交1、鑒定——分子水平的鑒定（3）翻譯檢測(cè)方法——抗原-抗體雜交提取轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)顯出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）第二十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1、鑒定——分子水平的鑒定（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌（含抗蟲基因）毒蛋白將毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗毒蛋白的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶從轉(zhuǎn)基因生物（抗蟲棉）中提取第二十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，A.蟲吃后中毒死亡，說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。B.蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明:①未攝入目的基因②攝入目的基因未表達(dá)。

目的基因表達(dá)的標(biāo)志：目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并賦予其特定性狀。第二十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日第三十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因人工合成（反轉(zhuǎn)錄法，化學(xué)人工合成）構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)(分子水平檢測(cè))：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定（個(gè)體水平鑒定）：抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)第三十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A第三十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)第三十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D第三十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日課堂練習(xí)4、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不需堿基互補(bǔ)配對(duì)，其余三個(gè)步驟都涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)第三十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日課堂練習(xí)4．(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．目的基因和受體細(xì)胞均可來自動(dòng)、植物或微生物B．限制酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D第三十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫(kù)導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存（2）.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法①基因組文庫(kù)的構(gòu)建第三十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA第三十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子啟動(dòng)子原核真核第三十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn):基因結(jié)構(gòu)第四十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)第四十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯第四十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日基因文庫(kù)的構(gòu)建方法①基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的全部DN