銀杏酸的熒光特征和光熱穩(wěn)定性研究

銀杏酸的熒光特征和光熱穩(wěn)定性研究楊小明，何軍，柳艷君，劉方【內容摘要】目的研究銀杏酸的熒光特征，討論光、熱對銀杏酸穩(wěn)定性的影響。方法通過熒光掃描研究溶劑、ph值對銀杏酸熒光特性的影響，建立檢測銀杏酸的熒光分光光度法。結果銀杏酸在ph4.0甲醇溶液中熒光強度較強，激發(fā)波長279nm，發(fā)射波長404nm時，銀杏酸在0.221～20.31μg/ml濃度范圍內與熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)為r=0.9975；檢測限0.0235μg/ml。結論銀杏酸溶液對光不穩(wěn)定，隨光照時間延長濃度降低；銀杏酸溶液在5℃時穩(wěn)定，25℃時穩(wěn)定性有所下降，并隨溫度升高或加熱時間延長降解率增大。該方法可用于測定光照、加熱對銀杏酸的影響?！颈疚年P鍵詞語】銀杏外種皮銀杏酸熒光分光度法光穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性abstract：objectivetostudythefluorescencecharacteristicsandtheheatandsunlightstabilityofginkgolicacid.methodstheeffectsonfluorescencecharacteristicsofginkgolicacidswithdifferentsolvent,differentphmediawerestudiedbyfluorescencescan.afluorescencespectrophotometryfordeterminationofginkgolicacidswasestablished.resultsitwasfoundthatintheph4.0methanolthefluorescencesignalofginkgolicacidswastheexcitationandemissionwavelengthginkgolicacidwereat279and404nmrespectively,thelinearrangewas0.221～20.31μg/ml,correlativecoefficientwas0.9975,andthedetectionlimitwas0.0235μg/ml.conclusionginkgolicacidsisunstabletosunlinght.ginkgolicacidsisstablewhenbeingexposedto5℃condition,butitsstabilitydepressedwhenbeingexposedover25℃conditions.themethodcanbeusedtoanalyzetheheatstabilityandsunlightstabilityofginlgolicacids.keywords：ginkgolicacids;fluorescencespectrophotometry;sunlightstability;heatstability銀杏酸〔ginkgolicacids,ga〕屬于6-烷基或者6-烯基水楊酸的衍生物，其苯環(huán)6位碳鏈長度13-17，雙鍵數(shù)0-2，為5種同系物所構成的混合物，存在于銀杏的葉、果和外種皮中，以外種皮中含量為高。銀杏酸能抑制多種細菌、真菌的生長，并能誘導腫瘤細胞的凋亡。作者發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮石油醚提取物具有突出的殺釘螺活性［1］，銀杏酸是其中的重要活性成分［2］，因而銀杏酸被以為是一種極具價值的殺螺劑或先導化合物。作為一栽種物來源的殺釘螺劑，銀杏酸的穩(wěn)定性在其使用中具有主要的意義。而到當前為止，國內外尚未見相關報道。當前已報道的銀杏酸分析方法重要有hplc-uv法［3］和hplc-ms聯(lián)用法［4］、紫外分光光度法［5］和熒光分光光度法［6］。hplc法測定精致細密度高，但對儀器要求高，分析操作復雜，成本較高；紫外分光光度法簡便但靈敏度較低；而熒光分光光度法在操作簡便的同時具有較高的靈敏度。田亞平［6］以白果酸為標準品采取熒光分光光度法測定銀杏外種皮中銀杏酸的含量。筆者采取從銀杏外種皮中分離的銀杏酸為標準品研究其熒光特征時，發(fā)現(xiàn)與田亞平報道有所差別，因而對銀杏酸的熒光特征進行具體研究，建立了熒光法測定銀杏酸的方法，研究了銀杏酸在不同溫度條件和光照下的穩(wěn)定性。1儀器與試劑caryeclipse熒光分光光度計〔美國varian公司〕；jascolc-1500高效液相色譜儀〔日本分光公司〕，配有pu-1580泵，pg-1580-54四通道在線脫氣，fp-1520熒光檢測器，n2000色譜工作站〔浙江大學智達信息工程〕；sartoriusbs124s分析天平〔北京賽多利斯儀器系統(tǒng)〕。銀杏酸標準品由本實驗室克己，經hplc測定純度98%〔與博士贈予的分析純度99%以上的銀杏酸對照品比較〕。銀杏酸標準品用無水甲醇配制成1.05mg/ml的儲備液。銀杏酸標準溶液的制備：精致細密汲取1.05mg/ml的銀杏酸儲備液用無水甲醇溶解定容于10ml容量瓶，即配制成濃度為105μg/ml的工作溶液。其余試劑均為分析純，水為去離子水二次蒸餾。2方法與結果2.1溶劑對銀杏酸熒光強度的影響取銀杏酸標準品分別以dmf、甲醇、丙酮、乙醇、正丁醇、甲醇-水〔7∶3〕，乙腈為溶劑配成100μg/ml進行熒光掃描；實驗溫度為(25±0.5)℃，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5nm，激發(fā)和發(fā)射單色器的掃描速度均為500nm·min-1。銀杏酸標準品在不同溶劑中的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別見圖1。在丙酮溶液中銀杏酸熒光特性消失；在dmf溶液中銀杏酸發(fā)生熒光淬滅；在正丁醇溶液中銀杏酸的發(fā)射強度很微弱。在其它4種溶液中，銀杏酸都出現(xiàn)位于229nm和279nm處的兩個熒光激發(fā)峰，和位于404nm和552nm附近的兩個熒光發(fā)射峰。比較發(fā)現(xiàn)甲醇溶液中銀杏酸激發(fā)熒光性最強。綜合考慮銀杏酸的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇甲醇溶液為溶劑，激發(fā)和發(fā)射波長分別為279nm和404nm。2.2ph條件對銀杏酸熒光強度的影響以甲醇-水〔7∶3〕為溶劑，配制100μg/ml銀杏酸標準液，分別在不同ph條件下測定其熒光強度。在ph值2～8之間，使用磷酸鹽緩沖體系；在ph值9.00～10.00之間，使用碳酸鹽緩沖體系，熒光測定條件同“2.1〞項。測定了不同ph條件下銀杏酸的相對熒光強度，結果發(fā)現(xiàn)隨著ph值的增長，銀杏酸的熒光強度略有上升，當ph4時，熒光性跨越儀器檢測最高值,這與文獻［6］報道一致。因而選擇在ph4.0條件下進行熒光測定。2.3高效液相-熒光法分析干擾物的影響色譜條件：大連elitesinochromods-ap色譜柱〔250mm×4.6mm，5μm〕；熒光檢測器，激發(fā)波長279nm，發(fā)射波長404nm；流動相：甲醇-3％hac水溶液〔92∶8，v/v〕；流速1.0ml/min，柱溫40℃。銀杏酸標準品的高效液相-熒光色譜圖見圖2。由圖2可見銀杏酸標準品的高效液相熒光圖上未見熒光雜質，故可直接采取熒光分光光度計直接進行測定。2.4熒光分光光度法的線性范圍和檢測限將銀杏酸工作液稀釋成一系列濃度，按試驗方法分別測定在404nm下的熒光強度，以熒光強度對相應濃度作圖，繪制標準曲線。在一樣條件下測定樣品溶液中銀杏酸的熒光強度，通過標準曲線計算其含量。配制一系列不同濃度銀杏酸工作液，按實驗方法在激發(fā)波長279nm，發(fā)射波長404nm的條件下，以無水甲醇作為空白，測定銀杏酸標準工作溶液的熒光強度，發(fā)現(xiàn)銀杏酸濃度在0.221～20.31μg/ml范圍內與熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關系，其線性回歸方程為：y=44.19x+82.80，相關系數(shù)為r2=0.995；相對標準偏差為2.1%〔n=10〕。取20份空白液測定其熒光強度，以3倍標準偏差計算其檢測限為0.0235μg/ml。2.5精確度與精致細密度2.5.1精致細密度考察取0.1mg/ml銀杏酸溶液1ml于10ml容量瓶中，無水甲醇定容，測定其熒光強度，反復5次，得銀杏酸溶液的rsd為0.47%〔n=5〕。2.5.2精確度考察取0.1mg/ml銀杏酸溶液1ml于10ml容量瓶中，無水甲醇定容，測定其熒光強度，反復5次，得銀杏酸溶液的rsd為0.75%。2.6樣品分析精確稱取一定量的銀杏酸對照品以甲醇定容，作為樣品溶液，分別按本法和文獻［3］hplc-uv分析條件進行檢測，結果見表1?？梢姛晒夥止夥ㄅchplc法測定結果基本一致，因而能夠采取熒光光度法進行樣品中銀杏酸含量的分析。表1采取熒光光度法與高效液相色譜法測定銀杏酸結果的比較〔略〕2.7銀杏酸光、熱穩(wěn)定性精確移取銀杏酸工作液15ml于具塞比色管中，密封后分別置于5，25，40，70℃恒溫，每間隔24h取樣，測定銀杏酸的含量，求出分解率。每處理設置3個平行。精確移取銀杏酸工作液20ml置于直徑為9cm的石英比色皿中，封口后將石英比色皿放置在陽光下照耀〔天天8h，夜間或陰天將比色皿保存于冰箱〕；一份外表皿用鋁箔遮蓋，并放置在陰暗處比照。每間隔24h定時取樣，測定銀杏酸的含量，求出分解率。光照實驗在間隔地面15m的樓頂平臺進行，光照時候堅持石英比色試管與太陽光線成30。角，測定光強為35000～65000lx，黑暗對照以鋁箔包裹同樣條件下光照，每處理設置3個平行。銀杏酸置于5，25，40，70℃恒溫水浴鍋中分別恒溫1，2，3，4，5，6d后，銀杏酸的濃度變化見圖3～4。由圖3可見,銀杏酸在5℃時穩(wěn)定,濃度不發(fā)生變化；溫度升至25℃以上，隨著處理時間的延長，濃度略有下降，溫度越高，銀杏酸濃度降低越多，說明高溫對銀杏酸的穩(wěn)定性有較大影響；由圖4可見，在太陽光照耀下，銀杏酸的濃度隨照耀時間的延長而降低。說明銀杏酸具有熱、光的不穩(wěn)定性。3結論本法具有簡便，檢測限低的特點，測定結果與hplc法基本吻合，可用于銀杏酸純品的分析。如樣品中含有熒光雜質，則測定前必需進行純化。由分析結果可知銀杏酸在高溫和光照條件下不穩(wěn)定，在天然條件下能夠降解?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】［1］陳盛霞，楊小明，吳亮，等.銀杏外種皮提取物滅釘螺效果的研究［j］.中國寄生蟲與寄生蟲病雜志，2007，25〔1〕：45.［2］楊小明，陳盛霞，張蓉仙，等.銀杏外種皮石油醚提取物的殺釘螺活性研究［j］.，2006，11〔10〕：961.［3］仰榴青,吳向陽，陳鈞.高效液相色譜法測定銀杏外種皮中銀杏酸的含量［j］.分析化學,2002,30〔8〕:901.［4］ndjokok,wolfenderj-l,hostettmannk.determinationoftraceamountsofginkgolicacid