保健食品原料用菌種安全性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(2022年版)

10保健食品原料用菌種安全性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則〔2023〕范圍本指導(dǎo)原則規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌、絲狀真菌〔子實(shí)體除外〕和酵母的安全性評(píng)價(jià)中的致病性〔毒力〕檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)程序和方法。本指導(dǎo)原則適用于保健食品原料用菌種〔包括保健食品配方用及原料生產(chǎn)用菌種〕的致病性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)。本指導(dǎo)原則不適用于基因改造微生物菌種和在我國(guó)無(wú)使用習(xí)慣的菌種致病性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)。術(shù)語(yǔ)和定義致病性，Pathogenicity微生物感染宿主造成安康損害引起疾病的力量。產(chǎn)毒力量，Toxigenicity微生物產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。毒性，Toxicity微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體可能造成的潛在損害〔不良反響〕。對(duì)擬評(píng)價(jià)微生物菌種需提交的根本資料要求在進(jìn)展致病性評(píng)價(jià)試驗(yàn)前，菌種送檢單位需供給以下資料供評(píng)價(jià)單位審核。根本信息〔、來(lái)源及用途。菌種分類(lèi)學(xué)資料供給由有菌種鑒定資質(zhì)的機(jī)構(gòu)出具的對(duì)擬評(píng)價(jià)菌種的標(biāo)準(zhǔn)、科學(xué)的分類(lèi)學(xué)〔屬、種名稱(chēng)及株〕資料。細(xì)菌的分類(lèi)和命名應(yīng)遵循原核生物分類(lèi)學(xué)國(guó)際委員會(huì)〔InternationalCommitteeonSystematicsofProkaryotes〕的規(guī)定，并符合原核生物國(guó)際命名法規(guī)〔InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes〕要求。真菌的分類(lèi)和命名應(yīng)按國(guó)際藻類(lèi)、真菌〔InternationalCodeofNomenclatureforalgae,fungi,andplants〕進(jìn)展。菌種鑒定資料依據(jù)目前已有的學(xué)問(wèn)，供給基于表型及基因測(cè)序技術(shù)鑒定到種水平的資料。作為保健食品的成效成分〔活菌〕，還應(yīng)供給鑒定到株水平的資料。菌種生長(zhǎng)環(huán)境條件資料供給擬評(píng)價(jià)菌種生長(zhǎng)最適培育基及培育條件〔培育時(shí)間、培育溫度和濕度、光照等〕，以及菌種保藏及復(fù)壯方法等相關(guān)資料。誘變菌種經(jīng)過(guò)誘變的菌種還需供給具體的菌種誘變方法〔包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變?cè)囼?yàn)流程等〕100代〔7天〕的遺傳穩(wěn)定性爭(zhēng)論報(bào)告。生產(chǎn)相關(guān)信息包括但不限于擬評(píng)價(jià)菌種安全用于保健食品的生產(chǎn)記錄、工藝流程、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等資料。國(guó)內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)資料綜述基于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，供給擬評(píng)價(jià)菌種的國(guó)內(nèi)外使用歷史和安全性評(píng)價(jià)資料，包括其致病性和產(chǎn)毒力量的報(bào)告、研究文獻(xiàn)或綜述等；假設(shè)無(wú)擬評(píng)價(jià)菌種的上述資料，應(yīng)供給在親緣關(guān)系上與其相近種屬的安全性評(píng)價(jià)資料。其他國(guó)家批準(zhǔn)資料供給其他國(guó)家已批準(zhǔn)擬評(píng)價(jià)菌種作為膳食補(bǔ)充劑、功能食品或一般食品生產(chǎn)使用的相關(guān)證明資料。其他需要說(shuō)明的信息。評(píng)價(jià)方法對(duì)已經(jīng)供給以上資料的擬評(píng)價(jià)菌株，可以依據(jù)以下方法開(kāi)展評(píng)價(jià)。全基因組測(cè)序〔WholeGenomeSequencing,WGS〕基因測(cè)序?qū)M評(píng)價(jià)菌株進(jìn)展全基因組測(cè)序，分別獲得其基因組完成圖和框架圖，測(cè)序報(bào)告應(yīng)包括〔但不限于〕以下信息：DNA提取方法測(cè)序方案及儀器設(shè)備序列組裝方法序列質(zhì)量評(píng)價(jià)FASTA文件與預(yù)期基因組大小相關(guān)的重疊群〔Contigs〕總長(zhǎng)度基因注釋流程對(duì)真菌而言，還需供給從相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的全基因組注釋質(zhì)量信息?；蛐蛄蟹治鰧M評(píng)價(jià)菌株的全基因組序列與已有的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括但不限于毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)〔VFDB〕、毒力/致病島數(shù)據(jù)庫(kù)〔PAIDB〕、生物防范數(shù)據(jù)庫(kù)〔MvirDB〕等最版本中存儲(chǔ)的序列進(jìn)展比對(duì)，并分析擬評(píng)價(jià)菌株遺傳物質(zhì)中與致病明確相關(guān)的毒力因子和毒素代謝相關(guān)基因的存在狀況。應(yīng)供給包括〔但不限于〕以下信息的分析報(bào)告：毒力/致病性〔或產(chǎn)毒〕相關(guān)基因名稱(chēng)、所在位置、與最數(shù)據(jù)庫(kù)中已有毒力基因的匹配度等信息編碼的蛋白及序列號(hào)毒力/致病因子〔毒素產(chǎn)生、侵襲和粘附因子等〕序列長(zhǎng)度掩蓋度≥60%輸入序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的匹配度〔≥85%〕和e值〔<10-5〕數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的菌株名稱(chēng)基因組圖譜擬評(píng)價(jià)的真菌菌株還應(yīng)依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道能夠產(chǎn)生的毒素類(lèi)別，針對(duì)性檢索是否存在毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇。動(dòng)物致病性試驗(yàn)由具備菌種致病性檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)，分別依據(jù)附ABC品用細(xì)菌、絲狀真菌、酵母菌株開(kāi)展致病性檢驗(yàn)，對(duì)結(jié)果做出評(píng)價(jià)并出具報(bào)告。產(chǎn)毒試驗(yàn)對(duì)某些能夠產(chǎn)生毒素的微生物，應(yīng)在多種基質(zhì)和條件下〔單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分的液體組合等〕/相關(guān)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)展有毒活性代謝產(chǎn)物含量檢測(cè)。結(jié)果判定滿(mǎn)足以下全部條件者，可用于保健食品。動(dòng)物試驗(yàn)顯示無(wú)致病性。產(chǎn)毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，在受試的任何一種基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。依據(jù)現(xiàn)有學(xué)問(wèn)，全基因組序列分析未覺(jué)察存在已知的毒力/致病基因〔或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇〕。全基因組序列中覺(jué)察含有毒力/致病基因〔或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇〕，但動(dòng)物試驗(yàn)顯示不具有致病性、或產(chǎn)毒試驗(yàn)檢測(cè)到的有毒活性代謝產(chǎn)物但其水平較低，長(zhǎng)期攝入對(duì)人體安康無(wú)影響，結(jié)合國(guó)內(nèi)外使用歷史，可用于保健食品。動(dòng)物試驗(yàn)顯示具有致病性，或產(chǎn)生高水平有毒A(標(biāo)準(zhǔn)性附錄)保健食品原料用細(xì)菌致病性檢驗(yàn)方法范圍本方法規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗(yàn)方法。本方法適用于保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗(yàn)。設(shè)備和材料除微生物試驗(yàn)室常規(guī)滅菌和培育設(shè)備外，其他設(shè)備與材料如下：2.1恒溫培育箱：36℃±1℃。離心機(jī)：離心力3000g。0.1g0.001g。比濁儀。溫濕度計(jì)。2.6顯微鏡：10×～100×。厭氧培育裝置：厭氧罐、厭氧箱。無(wú)菌錐形瓶：容量100mL、500mL。無(wú)菌吸管：1mL〔0.01mL刻度10mL〔0.1mL刻度。無(wú)菌試管：16mm×160mm。無(wú)菌培育皿：直徑90mm。無(wú)菌量筒：容量100mL。100μL～1000μL。注射器：量程為100μL～1000μL。小鼠灌胃針頭。培育基和試劑無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5gNaCl溶于1000mL121℃高壓滅菌15min餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15min，制備LB瓊脂平板，備用。500mg半胱氨酸鹽酸50mL10mL0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培育基：商品化解后分裝，121℃高壓滅菌15min，待培育基冷卻至50℃左右時(shí)，參加按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)藏液，使培育基500μg/mL，備用。含有半胱氨酸鹽酸鹽MRS瓊脂平板：商品化MRS瓊脂培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后121℃高壓滅菌15mi5℃參加按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)藏液，使培育基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500μg/mL，用于制備含有半胱氨酸MRS瓊脂平板。含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板：商品化雙歧桿菌瓊脂培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加12℃高壓滅菌15mi左右時(shí)，參加3.4中制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)藏液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500μg/mL，用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板。試驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)昆明或ICR18.0g～22.0g。操作步驟全部擬評(píng)價(jià)的菌株必需使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑賜予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。腹腔注射菌株活化目前我國(guó)已批準(zhǔn)的可用于保健食品的細(xì)菌主要是雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，除這兩個(gè)屬以外的其他申報(bào)菌種在以下描述中均使用“其他細(xì)菌”。依據(jù)送檢菌株的保存狀態(tài)，將雙歧桿菌和乳桿菌首先接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRSLB肉湯或適于該菌生長(zhǎng)的最適液體培育基中，并置適宜的培育條件下〔包括培育溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等〕培育一定時(shí)間〔培育時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異〕。菌懸液制備5.1.1中活化的雙歧桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板或含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板〔乳桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板，其他細(xì)菌接種LB瓊脂平板或適應(yīng)于該菌生長(zhǎng)的最適培育基瓊脂平板〕，在規(guī)定的適宜培育條件下〔包括培育溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等〕培育肯定時(shí)間〔培育時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異〕后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理11鹽水中，充分混勻后，用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁，使最終菌懸液中的菌濃度到達(dá)5.0×107CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。注射404組〔每組不少于10只〕，包括雄性小鼠無(wú)菌生理鹽水比照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠無(wú)菌生理鹽水比照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2mL，即受試物組每只小鼠注射菌量不1.0×107CFU。觀看動(dòng)物腹腔注射后每天觀看1次，至少連續(xù)觀看21d。觀看并記錄小鼠皮膚和毛、眼睛和粘膜、呼吸狀況、肢抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象。試驗(yàn)前稱(chēng)量并記錄全部小鼠的體重，試驗(yàn)完畢后稱(chēng)量并記錄全部存活小鼠的體重。對(duì)于試驗(yàn)期間死亡的小鼠，盡可能準(zhǔn)確記錄小鼠的死亡時(shí)間，同時(shí)稱(chēng)重并記錄。經(jīng)口灌胃菌數(shù)預(yù)估無(wú)菌吸取上述5.1.1的培育液，分別加至兩個(gè)無(wú)菌離心管中，每管1mL，3000 g離心10min，棄去上清液后，12用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁，使最終菌懸液2.5×108CFU/mL和1.25×109CFU/mL，并分別記錄每mL培育液離心后所得沉淀物中細(xì)菌數(shù)調(diào)整至2.5×108CFU/mL和1.25×109CFU/mL時(shí)需參加的無(wú)菌生理鹽水的體積〔mL〕。菌懸液制備培育上清液的制備依據(jù)受試動(dòng)物總數(shù)和每只動(dòng)物的灌胃體積計(jì)算所需要的受試菌株培育液用量。吸取5.1.1培育液，將培育液一分為二，3000 g各離心10min后將上清液分別轉(zhuǎn)至100mL無(wú)菌量筒中，一份上清液用于菌懸液原液的制備，另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之一，作為5倍濃縮上清液，備用。菌懸液原液的制備5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度到達(dá)2.5×108CFU/mL所需要的生理鹽水體積，依據(jù)離心的培育物體積，按一樣比例參加5.2.2.1到達(dá)2.5×108CFU/mL〔上清液量不夠時(shí)可用空白培育基補(bǔ)齊〕。濃縮菌懸液的制備依據(jù)5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度到達(dá)1.25×109CFU/mL所需要的生理鹽水體積，依據(jù)離心的培育物體積，按一樣比例參加5.2.2.1獲得的51.25×109CFU/mL。灌胃小鼠不少于80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成8組〔每組不少于10只〕，包括雄性小鼠培育基比照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠5倍濃縮培育基比照組、雄性小鼠5倍濃縮小鼠55倍濃縮菌懸液組。20mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃，連續(xù)灌胃3d，首次灌胃前小鼠應(yīng)禁食過(guò)夜〔16h〕，灌胃后3h～4h喂食。觀看動(dòng)物經(jīng)口灌胃后每天觀看1次，至少連續(xù)觀看21d，觀看5.1.4。結(jié)果與報(bào)告對(duì)5.1和5.2的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和綜合評(píng)價(jià)，包括：受試物對(duì)動(dòng)物一般安康狀況有無(wú)不良影響。受試物對(duì)動(dòng)物體重等指標(biāo)的影響。受試物組動(dòng)物死亡狀況。假設(shè)受試物組動(dòng)物在試驗(yàn)期間未消滅中毒病癥或死亡，且體重等指標(biāo)與比照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可判定該菌株無(wú)致病性；假設(shè)受試物組動(dòng)物在試驗(yàn)期間消滅中毒癥狀或死亡，或試驗(yàn)期間體重等指標(biāo)與比照組相比有顯著性差異，即可判定該菌株具有致病性。B(標(biāo)準(zhǔn)性附錄)保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)方法范圍本方法規(guī)定了保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)方法。本方法適用于保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)。設(shè)備和材料除微生物試驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培育箱：28℃±1℃。0.1g。錐形瓶：容量為500mL。無(wú)菌吸管：1mL〔0.01mL刻度10mL〔0.1mL刻度。2.5顯微鏡：10×～100×。微量移液器及配套槍頭：量程為100μL～1000μL。血球計(jì)數(shù)板。注射器：量程為100μL～1000μL。小鼠灌胃針頭。溫濕度計(jì)。接種鉤。球磨儀或功能相當(dāng)?shù)膬x器。無(wú)菌培育皿：直徑90mm。3培育基和試劑麥芽汁瓊脂平板：商品化培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用121℃高壓滅菌15min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5gNaCl溶于1000mL121℃高壓滅菌15min如擬評(píng)價(jià)菌株在上述兩種培育基上的生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)孢子量均不抱負(fù)，可選用適于該菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的其他培育基。試驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)昆明或ICR18.0g～22.0g。操作步驟全部擬評(píng)價(jià)菌株必需使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑賜予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。腹腔注射菌懸液制備葡萄糖瓊脂平板〔紅曲霉屬菌株接種麥芽汁瓊脂平板〕或適于擬評(píng)價(jià)菌株生長(zhǎng)的培育基平板，28℃±1℃培育7d～14d后，挑取平板上的孢子，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度，并用適量無(wú)菌生理鹽5.0×107CFU/mL。28℃±1℃7d～14d或在適宜的誘導(dǎo)產(chǎn)孢條件下培育肯定時(shí)間后，挑取平板的菌絲體及孢子，用球磨儀〔或其他功能相當(dāng)?shù)膬x器〕將菌絲體磨碎，經(jīng)生理鹽水重懸后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整，使菌懸液中菌絲體片段數(shù)/孢子的最終濃度不低于5.0×107CFU/mL。注射小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組〔每組不少于10只〕，包括雄性小鼠生理鹽水比照組、雄性小鼠菌小鼠注射0.2mL，即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107CFU。觀看動(dòng)物腹腔注射后每天觀看1次，至少連續(xù)觀看21d，觀看A5.1.4。經(jīng)口灌胃菌懸液制備除制備的菌懸液中真菌孢子/菌絲體片段的濃度不低于×108CFU/mL5.1.1。灌胃小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組〔每組不少于10只〕，包括雄性小鼠生理鹽水比照組、雄性小鼠菌20mL/kg·BW1〔16h〕，3h～4h喂食。觀看動(dòng)物經(jīng)口灌胃后每天觀看1次，至少連續(xù)觀看21d，觀看A5.1.4。結(jié)果與報(bào)告對(duì)5.1和5.2的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和綜合評(píng)價(jià)，內(nèi)容同附錄A中的條款6。C(標(biāo)準(zhǔn)性附錄)保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)方法范圍本方法規(guī)定了保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)方法。本方法適用于保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)。設(shè)備和材料除微生物試驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培育箱：28℃±1℃。電子天平：感量為0.1g。錐形瓶：容量為500mL。無(wú)菌吸管：1mL〔0.01mL刻度10mL〔0.1mL刻度。2.5顯微鏡：10×～100×。微量移液器及配套槍頭：量程為100μL～1000μL。血球計(jì)數(shù)板。注射器：量程為100μL～1000μL。小鼠灌胃針頭。溫濕度計(jì)。接種環(huán)。離心機(jī)：離心力3000g。無(wú)菌培育皿：直徑90mm。無(wú)菌量筒：容量100mL。3培育基和試劑麥芽汁瓊脂平板：商品化培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用121℃高壓滅菌15min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。麥芽汁培育基：商品化培育基依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15min，制備麥芽汁培育基，備用。無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5gNaCl溶于1000mL121℃高壓滅菌15min如擬評(píng)價(jià)菌株在麥芽汁培育基上的生長(zhǎng)狀態(tài)不抱負(fù)，可選用適于該菌株生長(zhǎng)的其他培育基。試驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)昆明或ICR18.0g～22.0g。22操作步驟全部擬評(píng)價(jià)菌株必需使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑賜予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。腹腔注射菌懸液制備將擬評(píng)價(jià)菌株接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培育肯定時(shí)間〔培育時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異〕后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度，使菌懸液中5.0×107CFU/mL。注射404組〔每組不少于10只〕，包括雄性小鼠生理鹽水比照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水比照組及雌性小鼠菌懸液組，1.0×107CFU。觀看121d，觀看A5.1.4。26經(jīng)口灌胃菌株培育將菌株接種到麥芽汁培育基上，28℃±1℃培育肯定時(shí)間〔培育時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異〕后，備用。菌數(shù)預(yù)估無(wú)菌吸取上述5.2.1的培育液，分別加至兩個(gè)無(wú)菌離心管1mL，3000g10min，棄去上清液后，用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度