基因芯片地地的應(yīng)用

實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案基因芯片技術(shù)的應(yīng)用概述：隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入， 迫切需要能同時(shí)檢測(cè)大量靶基因表達(dá)的手段， 迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律?；蛐酒╣enechip ）,又稱DNA 微列陣（DNAmicroarray ）技術(shù)就是在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生的。本文介紹基因芯片的歷史和應(yīng)用。一、 認(rèn)識(shí)基因芯片技術(shù)（一）基因芯片技術(shù)發(fā)展歷史俄羅斯科學(xué)院恩格爾哈得分子生物學(xué)研究所和美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室 （ANL）的科學(xué)家們最早在文獻(xiàn)中提出了用雜交法測(cè)定核酸序列 （SBH）新技術(shù)的想法。當(dāng)時(shí)用的是多聚寡核酸探針。幾乎與此同時(shí)英國牛津大學(xué)生化系的 Sourthern 等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測(cè)序的國際專利。在這些技術(shù)儲(chǔ)備的基礎(chǔ)上， 1994年在美國能源部防御研究計(jì)劃署、俄羅斯科學(xué)院和俄羅斯人類基因組計(jì)劃1000多萬美元的資助下研制出了一種生物芯片，并用于檢測(cè)盡地中海病人血樣的基因突變，篩選了一百多個(gè)外地中海貧血已知的突變基因。這種生物芯片的基因譯碼速度比傳統(tǒng)的Sanger和MaxaxGilbert法快1000倍，是一種有希望的快速測(cè)序方法。1996年底，美國舊金山AFFYMATRIX公司StevenFodor等充分結(jié)合并靈活運(yùn)用了照相平板印刷、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、激光共聚焦掃描、寡糖苷酸DNA合成、熒光標(biāo)記探針雜交及分子生物學(xué)的其他技術(shù)，創(chuàng)造了世界上第一塊DNA芯片或DNA列陣（DNAchiporDNAarrays），即基因芯片。（二） 基因芯片技術(shù)原理基因芯片是一種小型分析裝置，能夠快速和精確地研究生物基因組信息。制作基因芯片時(shí)，可用機(jī)械臂把大量已知或未知序列的 DNA 片段點(diǎn)在玻璃片（通常為 2cm×2cm）、金屬片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化（ cDNA 芯片）。也可以直接在玻璃板或金屬精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案表面進(jìn)行化學(xué)合成， 從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的 cDNA 或其他樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理， 便可以觀察到成千上萬個(gè)基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控情況。熒光標(biāo)記的 cDNA 與芯片上相匹配的 DNA 序列發(fā)生雜交反應(yīng)，是的芯片上的點(diǎn)呈現(xiàn)出熒光信號(hào)， 熒光信號(hào)的強(qiáng)度和基因表達(dá)的多度呈正相關(guān)?；蛐酒@種微型化裝置具有巨大的容量， 是科學(xué)家在單次試驗(yàn)中就可以分析整個(gè)基因組的變化。（三） 幾種基因芯片的點(diǎn)制過程1. 簡(jiǎn)易芯片制作簡(jiǎn)易芯片時(shí)，使用機(jī)械臂把大量已知或未知序列的 DNA片段點(diǎn)在一張很小的玻璃片 （通常為2cm×2cm）或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化（ cDNA 芯片）。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的 cDNA 或其他樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理， 便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織、 同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)基因調(diào)控情況。 簡(jiǎn)易芯片一般的基因數(shù)量少 （一般不超過 2000），主要用于研究小部分特定基因的表達(dá)狀態(tài)。簡(jiǎn)易芯片一般可以用于手工制作或者機(jī)械手點(diǎn)樣。大規(guī)?；蛐酒笠?guī)?；蛐酒ǔＩ婕盎蚪M規(guī)模與數(shù)量 （一般大于 10000 個(gè)基因），分別采用接觸式點(diǎn)樣、非接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。 接觸式點(diǎn)樣方法包括點(diǎn)樣元件或點(diǎn)樣元件中的液體和芯片基片間有直接接觸的各種方法。 非接觸式芯片制備方法包括各種芯片制備中不需點(diǎn)樣元件和芯片基片間直接接觸的各種技術(shù)， 其樣頭的核心是以可控的方式從噴嘴中噴出小體積的液滴。半導(dǎo)體制備技術(shù)指借鑒計(jì)算機(jī)芯片制造業(yè)中的微型化加工方法的基因芯片制備技術(shù)?；蛐酒墓ぷ髁鞒倘缦拢壕饰臋n實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案1）經(jīng)大規(guī)模PCR擴(kuò)增獲得獨(dú)立cDNA插入片段。2）用機(jī)械手將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在玻璃板上，變性、固定。（3）分別從不同器官或組織中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。（4）用不同的熒光染料標(biāo)記不同器官或組織的cDNA。5）將標(biāo)記好的cDNA與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交。6）激光掃描芯片雜交結(jié)果，計(jì)算機(jī)處理。7）分析雜交數(shù)據(jù)。微珠芯片技術(shù)微珠芯片技術(shù)（ beadarray ）技術(shù)是一種新的基因芯片技術(shù)，有可能成為今后基因芯片技術(shù)發(fā)展的方向。目前，微珠芯片技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的用途主要集中在 SNP及基因型分析、基因表達(dá)譜分析和蛋白組學(xué)研究三大領(lǐng)域。 微珠芯片技術(shù)是在光導(dǎo)纖維技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)。在直徑為 3.5mm 的光纖束中，包含約 50000 跟光纖。在每根光纖的頂部蝕刻出一個(gè)小洞，可鑲嵌直徑為 3um 的微磁珠。每個(gè)微磁珠上可以根據(jù)不同的需求連接不同的配體，如寡核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體等。制作芯片時(shí)，將帶有所需配體的不同微磁珠混合后與光纖束進(jìn)行自組裝，通過微珠上寡核苷酸標(biāo)簽序列（ address）確認(rèn)每根光線上所吸附的不同的微珠。現(xiàn)有微珠芯片上每束光纖可鑲嵌 1536 種微珠，因此，每種微珠在一束光纖中有次重復(fù)。結(jié)合在微珠上的寡核苷酸或者蛋白可與熒光標(biāo)記的配對(duì)核酸或配體發(fā)生相互作用，發(fā)生的信號(hào)被激發(fā)后通過光纖傳遞到檢測(cè)器。與其他芯片制作技術(shù)相比較，微珠芯片具有如下優(yōu)勢(shì):(1)密度高 微珠芯片的點(diǎn)樣密度是原位光合成法的 16倍，噴點(diǎn)法的 100倍，接觸式點(diǎn)樣的400倍。(2)測(cè)試重復(fù)性好 鑒于超高密度的特點(diǎn)， 微珠芯片中每個(gè)樣品都能保證約 30個(gè)重復(fù)，從而精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案保證測(cè)試的高重復(fù)性、高重復(fù)率以及高可靠性。定制方便若需要在已完成的芯片中增加測(cè)試點(diǎn)或新基因，只要合成相應(yīng)的微珠加入到微珠混合池中即可。（四）基因芯片數(shù)據(jù)分析基因芯片分析包括五個(gè)基本步驟：生物學(xué)問題、樣品制備、生物化學(xué)反應(yīng)、檢測(cè)、數(shù)據(jù)模型分析?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析包括兩部分，數(shù)據(jù)可靠性分析和生物學(xué)意義分析。1.數(shù)據(jù)可靠分析因?yàn)橛没蛐酒M(jìn)行雜交分析，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有些變化，因?yàn)榘ò蠨NA濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度以及溫度等許多因素影響了雜合雙鏈的形成和穩(wěn)定性。因此，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。主要的方法是通過兩次平行雜交反應(yīng)，將每個(gè)基因在兩個(gè)反應(yīng)中的表達(dá)水平做成對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45度斜線附近，就說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可的。為了保證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，芯片中還需加上多個(gè)持家基因（housekeepinggenes）作為內(nèi)對(duì)照。持家基因，如呼吸作用的酶類和細(xì)胞骨架蛋白基因等，是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的必須基因，其表達(dá)水平在細(xì)胞內(nèi)基本不變。處理數(shù)據(jù)時(shí)，認(rèn)為持家基因的反應(yīng)信號(hào)在兩種組織中不變，依此確定其他基因表達(dá)信號(hào)的相對(duì)值。2. 生物學(xué)意義分析主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)， 研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。 通常，在芯片中某一器官或發(fā)育時(shí)期可能有成千上萬個(gè)差異表達(dá)基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有 400 多個(gè)特意表達(dá)的基因， 如果要將這些基因的來龍去脈都搞清楚， 可能要追溯超過 4000篇以上的文獻(xiàn)（假設(shè) 1個(gè)基因需要查閱 10篇文獻(xiàn)）。這種不撿重點(diǎn)的方法耗時(shí)耗力，所獲得的結(jié)果也往往沒有意義。 因此，生物學(xué)家和生物信息學(xué)家合作創(chuàng)立了將差異表達(dá)基因定位于不同精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案的生物化學(xué)代謝途徑的分析方法（ pathway identification ）。統(tǒng)計(jì)每條生物化學(xué)代謝途徑中固有的基因數(shù)量和被基因芯片定位的差異表達(dá)的基因數(shù)量， 可以計(jì)算出特定器官或特定發(fā)育階段表達(dá)有顯著差異的代謝途徑。 由于代謝途徑通常負(fù)責(zé)執(zhí)行生物體的重要功能， 并且相對(duì)于原始數(shù)據(jù)，代謝途徑的數(shù)量相對(duì)較少， 可操作性強(qiáng)，已經(jīng)成為目前學(xué)術(shù)界分析芯片技術(shù)數(shù)據(jù)的重要手段。二、 應(yīng)用實(shí)例基因芯片法鑒定學(xué)培養(yǎng)標(biāo)本中致病菌（一）材料和方法1.材料收集廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室 2008 年2~7 月臨床科室送檢血液培養(yǎng) 86例經(jīng)BacTAlert120 全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀中培養(yǎng)作為待測(cè)樣品其中陽性血培養(yǎng)瓶 74例陰性血培養(yǎng)瓶12例。2.方法（1）常規(guī)細(xì)菌分離鑒定 臨床送檢血培養(yǎng)瓶按常規(guī)方法經(jīng) BacT Alert 120全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種至血平板、麥康凱培養(yǎng) 24h。細(xì)菌鑒定采用 Gp、Gn卡，Gp卡質(zhì)控菌為金黃色葡萄球菌（ ATCC25923），Gn卡質(zhì)控菌為大腸桿菌（ ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27835），鑒定結(jié)果由 VITEK2-compact 軟件專家系統(tǒng)來判定。2）基因芯片法細(xì)菌鑒定①標(biāo)本中細(xì)菌模板DNA的制備陽性、陰性對(duì)照品均由試劑盒提供， 陽性對(duì)照品為大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制作成的干粉， 用鑒定為陰性的血培養(yǎng)瓶液 450ul 溶解待用；在生物安全柜中，陽性、陰性對(duì)照品及待測(cè)樣品顛倒混勻 5次，取450ul 分別加入離心管中，待測(cè)樣品做雙平行管；各管加 900ul 提取液精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案Ⅰ，混勻10min，13000g離心5min，棄上清，沉淀用500ul提取液Ⅱ重懸，13000g離心5min，棄上清，重復(fù)一次；沉淀用100ul提取液Ⅲ重懸，100℃煮沸10min，13000g離心15min，取上清60ul作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。②擴(kuò)增和標(biāo)記PCR雙鏈擴(kuò)增向3.8ulPCR反應(yīng)體系Ⅰ中加23.2ul水和3ul模版DNA，總體積30ul，37℃15min，94℃預(yù)變性10min，94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。產(chǎn)物純化將純化柱置于收集管內(nèi)加370ul水將擴(kuò)增產(chǎn)物全部移至純化柱內(nèi)，室溫3000g離心15min，棄廢液，加 30ul水，37℃放置5min，取純化柱倒置于無菌離心管，室溫1000g 離心2min，收集純化后 DNA溶液。PCR單鏈標(biāo)記 向3.9ulPCR 反應(yīng)體系 II（含熒光標(biāo)記物 Cy3-dutp ）中加16.1ul 水和10ul已純化的 DNA溶液，總體積 30ul，94℃預(yù)變性 10min，94℃變性40s，58℃退火40s，℃延伸40s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。③雜交將150ul 水均勻加入雜交盒槽板的兩道平行水槽內(nèi)，取出芯片及蓋片， 50℃水浴預(yù)熱雜交液5min，取8ul 預(yù)熱后雜交液與 8ul 標(biāo)記后的擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，用微量加樣器將全部混合液垂直轉(zhuǎn)移至芯片的雜交區(qū)域避免， 產(chǎn)生氣泡；組裝雜交盒 50℃水浴1.5h；將雜交后的芯片依次于室溫下在洗液 A和洗液B中各提洗 3min（30次/min），無水乙醇中提洗 1.5min30次/min），烘干。④掃描將雜交后的芯片置于芯片激光共聚焦掃描儀（ LuxScan-10k/A ）掃描儀掃描芯片，并按照操作說明書進(jìn)行成像掃描，保存圖象。在特定區(qū)域上掃描雜交圖像（λ =532 nm），分辨率精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案10ul，Laserpower ：95%，PMT：600。⑤結(jié)果判讀用配套的 BactarrayAnalyzer 軟件系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度和比值， 質(zhì)量控制正常（陽性對(duì)照品：點(diǎn)樣質(zhì)控探針、陽性特異探針、 細(xì)菌通用探針均有較明顯的雜交信號(hào)； 陰性對(duì)照品：點(diǎn)樣質(zhì)控探針陽性，無其他雜交信號(hào)；軟件系統(tǒng)分析陰、陽性對(duì)照均正常 )下，根據(jù)軟件系統(tǒng)分析提示的細(xì)菌作為結(jié)果報(bào)告。判斷標(biāo)準(zhǔn)：探針雜交熒光信號(hào)平均值 =探針雜交信號(hào)平均值 -背景雜交信號(hào)平均值。3.統(tǒng)計(jì)分析方法以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定方法為金標(biāo)準(zhǔn)，采用配對(duì) X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（二）基因芯片結(jié)果1.基因芯片結(jié)果以金黃色葡萄球菌為例， Bactarray Analyzer 軟件系統(tǒng)分析陰、陽性對(duì)照均正常，基因芯片檢出陽性的標(biāo)本特異探針及細(xì)菌通用探針有較明顯的雜交信號(hào)， 未檢出的標(biāo)本雜交信號(hào)不明顯或無雜交信號(hào)。2.基因芯片結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌鑒定結(jié)果比較86例臨床標(biāo)本中全自動(dòng)血培養(yǎng)儀培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)種至血平板，麥康凱平板鑒定，陽性 74例，陰性18例，陽性率 86.05%；基因芯片檢測(cè)血培養(yǎng)陽性 48例，陰性38例，陽性率 55.81%?；蛐酒Y(jié)果與常規(guī)細(xì)菌鑒定結(jié)果差異有顯著性意義。參考文獻(xiàn)：【1】 現(xiàn)代分子生物學(xué)（第3版），朱玉賢、李毅、鄭曉峰；高等教育出版社；P214-218【2】 基因芯片法鑒定學(xué)培養(yǎng)標(biāo)本中致病菌的臨床評(píng)價(jià)， 李林海等；南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)；2009；29（10）：2070-2072精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案【3】 白東亭，祁自柏。基因芯片應(yīng)用前景 J。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2002,30(4) ：100-6。4】李國利，莊玉輝，趙銘，等。聚合酶鏈反應(yīng)-反相斑點(diǎn)雜交鑒定分枝桿菌菌種J中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,，2000,23(4)：241-3?！?】 李慧卿，韓金祥。生物芯片在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用 J。國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè) ,，2002，23(1)：12-20?！?】PepliesJ，GlcknerFO，AmannR。OptimizationstrategiesforDNAmicroarray-baseddetectionofbacteriawith16SrRNA-targetingoligonucleotideprobesJ。ApplEnvironMicrobiol，2003,69(3)：1397-407.【7】黃正根，劉昕。應(yīng)用16SrDNA檢測(cè)致病菌的研究進(jìn)展J。中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(6)：663-5?！?】李禾，徐琦，吳忠華，等?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)3種腸道病原微生物方法的建立J。生物技術(shù)通訊,2007，18(3)：441-5?！?】肖光夏。全身性外科感染【M】//吳在德。外科學(xué).5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：185-8?！?0】劉正祥，鄒全明?；蛐酒诓≡⑸餀z