感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化

感受態(tài)感受態(tài)即應(yīng)用各種理化方法處理誘導(dǎo)細(xì)胞，使其最適合攝取和外DNA的生理狀態(tài)，此時(shí)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞?？寺「惺軕B(tài)：JM109TG1表達(dá)感受態(tài)：BL21需準(zhǔn)備的器材和試劑：1.5mLEP管一盒，藍(lán)，黃槍頭各一盒，移液管若干，求配置）LB液體培養(yǎng)基。大腸桿菌感受態(tài)的方法：CaCl2法，TFB法，TSS一步法，Inoue效法等，最常用的方法就是CaCl2法。下面具體介紹CaCl2法。CaCl2法感受態(tài)的原理0℃的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變DNADNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞CaCl2法感受態(tài)的步驟1ml100mlLB37℃200～300r/min250ml10～20min3、4℃4000r/min10min410ml0.1mol/LCaCl220min5、4℃，4000r/min10min650ml2ml0.1mol/LCaCl2-14%甘油溶液重懸每份7、將重懸的菌液分裝至滅菌預(yù)冷的EP管，每管100～200μL,-80℃?zhèn)溆谩Ｐ枰獪?zhǔn)備洗液EPB，和EPWB從37℃培養(yǎng)24～30h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，37℃靜置培養(yǎng)16～20h，1ml100ml2%甘氨酸的MRS或M17擴(kuò)大培養(yǎng)37℃4～6h1hOD600OD6000.4～0.8。50ml10～20min4℃3500r/min10min20ml冰預(yù)冷的EPWB溶液重懸菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集20ml冰預(yù)冷的EPWB溶液重懸菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收20ml冰預(yù)冷的EPB溶液重懸菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集細(xì)20ml冰預(yù)冷的EPB溶液重懸菌沉淀，4℃，3500r/min10min，收集100ml2ml冰預(yù)冷的EPBEP0.8CaCl2溶液：200ml2.22gCaCl2 EPWB溶液 200ml,調(diào)PH7.4 EPB溶液 蔗 200ml,調(diào)PH7.4轉(zhuǎn)化指同源或異源的“露”DNA分子被感受態(tài)細(xì)胞攝取并得到表達(dá)的DNA和蛋白質(zhì)，不可能自由通過(guò)質(zhì)膜。電穿孔術(shù)利用磷脂雙層疏水與親水基團(tuán)電轉(zhuǎn)杯（平時(shí)泡在75%的中）紫外燈下照2h以上，蓋好蓋子，置于新PE手套內(nèi)，-20℃30minDNA0.5-1mm電擊杯：100 2mm電擊杯：200微升DNA的混合物轉(zhuǎn)至預(yù)冷的電擊杯中，電擊杯放入滑板中，將滑板推1ml恢復(fù)培養(yǎng)基，輕柔混合，再將混合物吸出加入4mL恢復(fù)培養(yǎng)基中，37℃2-3h。6.1mL800μl，重懸菌體，涂布相應(yīng)抗性的平板。氨芐霉素抗性：1mL培養(yǎng)基+2μl氨芐霉素溶液卡那霉素抗性：1mL培養(yǎng)基+5μl卡那霉素溶液氯霉素抗性：1mL培養(yǎng)基+1μl氯霉素溶液DNA樣品和感受態(tài)細(xì)胞溶液一定要低電阻.可以用無(wú)水乙醇和醋酸鈉洗滌連接產(chǎn)物DNA純度最好高,否則影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞恢復(fù)保證電擊杯預(yù)冷并干燥.在室溫條件下電擊,100迅速加入恢復(fù)培養(yǎng)基,DNA分子過(guò)飽和，反而不利于轉(zhuǎn)化。DNA1min孵育時(shí)間在2h內(nèi)隨著孵育時(shí)間變長(zhǎng)而轉(zhuǎn)化效率提高，但高于2小時(shí)后，延長(zhǎng)電壓:球菌2-2.5kv桿菌1.6-2kv電擊