彗星試驗和斑馬魚胚胎發(fā)育試驗檢測飲用水源水的生物毒性

彗星試驗和斑馬魚胚胎發(fā)育試驗檢測飲用水源水的生物毒性摘要：應用人外周血淋巴細胞彗星試驗，小鼠睪丸細胞彗星試驗以及斑馬魚胚胎發(fā)育試驗，對蘇南地區(qū)代表性飲用水源水的生物毒性進行了檢測。彗星試驗的結(jié)果表明，各水樣中有機濃集物均能對人外周血淋巴細胞和小鼠睪丸細胞產(chǎn)生不同程度的DNA損傷。斑馬魚胚胎試驗的結(jié)果表明，在所設劑量范圍內(nèi)，各水樣均能對斑馬魚胚胎發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響。研究表明上述三種試驗方法可有效地檢測水中有機污染物的生物毒性。關(guān)鍵詞：飲用水，有機污染物，彗星試驗，人外周血淋巴細胞，小鼠睪丸細胞，斑馬魚胚胎發(fā)育試驗ToxicityevaluationofdrinkingwatersourcesusingthecometassayandthezebrafishembryotestAbstract：Inthisstudy,thetoxicpotentialsoforganicpollutantsinsomerepresentativedrinkingwatersourcesofJiangsuProvincewereinvestigatedusingthecometassay(inhumanperipheralbloodlymphocytesandmousetesticularcells)andthezebrafishembryotest.TheresultsofthecometassayshowedthatDNAdamagesinhumanlymphocytesandmousetesticularcellswereinducedafterexposuretotheorganicextractsfromthewatersamples.Andthewatersamplescouldaffectthedevelopmentofzebrafishembryoalso.Theresultsofthisstudydemonstratethatallthesetestscanbesuccessfullyappliedtothetoxicitymonitoringprogramofdrinkingwatersources.Keywords：Drinkingwater，Organicpollutant，Cometassay，Humanperipheralbloodlymphocyte，Mousetesticularcell，Zebrafishembryotest飲用水與人體健康直接相關(guān)。自從70年代初美國環(huán)保局首次在水中發(fā)現(xiàn)氯的衍生物以來，水中有機物對人體健康的影響已日益引起人們關(guān)注[1]。由于此類有機物大都呈現(xiàn)低劑量長期暴露的特點，常規(guī)的理化分析不足以對水質(zhì)狀況作全面的評價，因此，有必要建立一種有效的測試方法評價水中有機物的對生物，特別是對人的毒性，以準確直觀地反映水體對人體健康的潛在危害。 彗星試驗是一種快速、簡便、靈敏的檢測單個細胞DNA斷裂的技術(shù)，近年來由于其諸多優(yōu)點正越來越多地在環(huán)境監(jiān)測方面得到廣泛的應用[2]。與傳統(tǒng)魚類急性毒性試驗相比，斑馬魚胚胎發(fā)育試驗由于其成本低、影響因素少，敏感度高等優(yōu)點，大有取代前者的可能，同時其不同發(fā)育階段可為化合物毒理學研究提供特殊的信息，使其在分析綜合污水中的毒性物質(zhì)、毒物作用機理方面具有獨特的優(yōu)勢[3]。本文采用人外周血淋巴細胞彗星試驗、小鼠睪丸細胞彗星試驗以及斑馬魚胚胎發(fā)育試驗，研究了不同水樣的生物毒性，有助于為水體安全監(jiān)測提供有效的測試方法和指標。材料和方法1.1試驗材料健康人外周肝素抗凝全血，采自南京市中心血庫。昆明種雄性小鼠，體重30克左右，由南京大學生命科學院動物房提供。常規(guī)喂養(yǎng)，觀察一周后，健康者供試驗用。斑馬魚，購于南京市花鳥市場。飼養(yǎng)產(chǎn)卵魚于玻璃缸內(nèi)，光周期為12hr/12hr，雌雄比例為1：2，水溫26±1℃，DO>7mg/L，飼料為干飼料和紅蟲。試驗用水為標準稀釋水。1.2水樣的采集與處理于2003年12月采集無錫小灣里水源廠源水，常州西石橋水廠源水及長蕩湖湖心水樣。其中，無錫小灣里水源廠水源地為太湖梅梁灣，常州西石橋水廠水源地為長江，長蕩湖為常州金壇市擬用水源地。各采樣點采樣量均為100L。水樣靜置24hr，過濾去除懸浮顆粒，通過XAD-2樹脂吸附柱富集，控制流速在30-40mL/min，N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷洗脫，洗脫液用氮吹儀在50℃條件下濃縮，吹干，再用二甲基亞砜（DMSO）溶解，定容至2.0mL，避光保存于-18℃冰箱中備用。1.3彗星試驗1.3.1人外周血淋巴細胞彗星試驗1.3.1.1人外周血淋巴細胞分離和染毒明膠法分離淋巴細胞并分裝于微量離心管中，加PBS0.9mL及水樣濃集物0.1mL，37℃染毒1hr。每個水樣設三個劑量（即相當于原水樣20mL、100mL、500mL/管）。染毒后離心棄上清，沉積細胞置4℃冰箱中備用。同時作DMSO溶劑對照。用苔盼藍染色觀察細胞存活率（>90%）。1.3.1.2彗星試驗及結(jié)果評價彗星試驗方法參見Singh報道[4]。鋪好膠層的玻片在冷細胞裂解液裂解1hr后，在堿性電泳液（pH＝13.0）靜置，解旋30min。調(diào)節(jié)電壓為25V，電流為100mA，電泳1hr。以上各步驟應在紅光或黃光下進行，以免產(chǎn)生額外的DNA損傷。電泳后，經(jīng)中性緩沖液中和，在24hr內(nèi)，每張玻片以50μL溴乙錠（EB）染色，熒光顯微鏡下觀察并進行損傷評價。一個典型彗星包括頭部和尾部，不同程度損傷根據(jù)可見熒光的尾部與其可見頭部的比例大小而分為0，1，2，3，4五個等級。每張玻片觀察100個左右細胞，計算細胞損傷專用單位（Arbitraryunits），方法如下：Arbitraryunits＝×Ni，其中i：損傷等級(0,1,2,3,4)；Ni：i級的細胞數(shù)[5]。采用SPSS軟件，以單因素方差分析（ANOVA）比較各劑量組與溶劑對照間的損傷差異。考慮到高劑量的染毒可能造成DNA的嚴重損傷，從而使大量的DNA游離斷片在電泳過程中丟失而引起可測DNA損傷的降低[6]，而劑量過低可能使組間差異難以充分表現(xiàn)，所以本文以100mL/管這一劑量對各水樣間的遺傳毒性進行多重比較。組間的多重比較采用Duncan檢驗法，顯著性水平為0.05。1.3.2小鼠睪丸細胞彗星試驗1.3.2.1小鼠睪丸細胞分離和染毒小鼠睪丸細胞分離參考張遵真[7]的方法。將制得的睪丸細胞分裝于微量離心管，加DMEM0.9mL及水樣濃集物0.1mL，34℃染毒1hr。劑量設定同人血淋巴細胞彗星試驗。染毒后離心，沉積細胞置4℃冰箱中備用。同時作DMSO溶劑對照。鋪膠前用苔盼藍染色觀察細胞存活率（>90%）。1.3.2.2彗星試驗及結(jié)果評價同人血淋巴細胞彗星試驗。1.4斑馬魚（Daniorerio）胚胎發(fā)育試驗1.4.1斑馬魚受精卵的收集和染毒受精卵的收集和染毒參照OECD的操作指南[8]。選用24孔培養(yǎng)皿，每孔加入2mL水樣濃集物，放一枚受精卵。每張多孔板為一個實驗濃度組，其中4個孔以曝氣稀釋水作為組內(nèi)對照。每個水樣設5個劑量組，同時設空白對照。試驗中作為溶劑的DMSO濃度不高于0.25％。將多孔培養(yǎng)皿放置在恒溫光照培養(yǎng)箱中孵化，培養(yǎng)條件為26±1℃，光照周期12hr/12hr。各水樣每個劑量組至少作3個平行。1.4.2觀察及結(jié)果評價定時在倒置顯微鏡下觀察，并記錄胚胎發(fā)育情況。以斑馬魚胚胎96hr能否正常孵化為毒理學終點，各水樣各劑量組與空白水樣間的差異以χ2進行顯著檢驗。試驗結(jié)果2.1彗星試驗2.1.1人外周血淋巴細胞彗星試驗 各水樣中有機濃集物對人外周血淋巴細胞彗星試驗的結(jié)果見表1。從表中可以看出，從表中可以看出，各水樣濃集物均能引起不同程度的DNA損傷，與溶劑對照相比均有極顯著差異(P<0.01)。隨著劑量的加大，DNA受損的程度也加重。以100mL/管這一劑量組進行多重比較表明，對人血淋巴細胞DNA損傷程度為小灣里水源廠源水、金壇長蕩湖湖心水樣>常州西石橋水廠進水。表1西石橋水廠進水、長蕩湖湖心水樣和小灣里水源廠進水（2003.12）有機濃集物對人外周血淋巴細胞DNA的損傷水樣染毒劑量（mL//管）細胞損傷分級（％％）DNA損傷專用單單位（AU）01234西石橋水廠進水2010.07±100.1876.74±8..4713.20±8..6300103.13±116.87***100066.44±133.3831.43±133.182.13±1.0070135.69±113.64***a500033.75±9..8454.87±122.2810.21±7..381.17±1.443178.80±112.85***長蕩湖湖中心2029.56±4..7949.18±2..1421.25±3..730091.69±8..32**100037.34±122.3746.46±100.3616.04±4..040.16±0.335179.01±115.48***b500014.54±6..8640.68±7..3941.32±5..163.46±1.550233.71±99.39***無錫小灣里水源廠廠進水200.74±1.22786.61±1..9111.68±0..170.97±0.6690112.89±00.66***100042.06±6..1934.93±8..1720.00±2..363.01±1.330183.95±55.57***b50001.61±1.22151.84±3..4041.35±4..585.20±1.881250.14±11.95***溶劑對照073.02±3..2025.67±3..161.30±0.7700028.28±3..39注：1.數(shù)據(jù)以meean±SDD表示，*：P<0.005,***:P<0.01;;2.以100mmL/管進行多重重比較，相同同字母表示無無差異，顯著著性水平為0.05。2.1.2小鼠睪丸細胞彗星試驗表2西石橋水廠進水、長蕩湖湖心水樣以及小灣里水源廠進水（2003.12）有機濃集物對小鼠睪丸細胞DNA的損傷水樣染毒劑量（mL//管）細胞損傷分級（％％）DNA損傷專用單單位（AU）01234西石橋水廠進水2036.44±5..4451.87±5..8111.69±1..880075.26±5..71**1001.91±1.33152.94±6..4541.33±4..033.82±2.5530147.05±66.26***a500013.10±3..7843.39±2..1938.89±6..504.61±2.554253.00±88.47***長蕩湖湖心2025.93±1..7545.02±6..0228.24±6..320.80±0.7760103.91±88.43***1005.56±1.77917.24±2..5737.16±7..2737.14±3..872.91±1.554214.61±55.89***b500－－－－－－小灣里水源廠進水水2015.34±1..6448.70±2..5235.56±3..500.40±0.5500121.03±44.76***100016.93±3..1939.38±3..5536.20±4..027.49±1.223234.25±55.09***c500－－－－－－溶劑對照051.74±5..2547.53±5..020.74±1.2270049.00±5..76注：1.數(shù)據(jù)以meean±SDD表示，*：P<0.005,***:P<0.01;;2.以100mmL/管進行多重重比較，相同同字母表示無無差異，顯著著性水平為0.05。各水樣中有機濃集物對小鼠睪丸細胞彗星試驗的結(jié)果見表2。其中長蕩湖湖心、小灣里水源廠進水高劑量組（500mL/管）對DNA損傷極高而難以準確計算，故不列出。從表中可以看出，各水樣濃集物均能引起小鼠睪丸細胞不同程度的DNA損傷，與溶劑對照相比均有極顯著差異(P<0.01)。隨著劑量的加大，DNA受損的程度也加重。以100mL/管這一劑量組進行多重比較表明，對小鼠睪丸細胞DNA損傷程度小灣里水源廠源水>金壇長蕩湖湖心水樣>常州西石橋水廠進水。2.2斑馬魚胚胎發(fā)育試驗試驗結(jié)果見表3。從表3中可以看出，與空白對照相比，常州西石橋水廠進水、金壇長蕩湖湖心水樣和無錫小灣里水源廠進水分別在濃縮倍數(shù)125、62.5和7.812時能對斑馬魚胚胎96hr正常孵化率產(chǎn)生極顯著影響（P<0.01）。所以，各水樣有機物對斑馬魚胚胎的影響程度為無錫小灣里水源廠進水>金壇長蕩湖湖心水樣>常州西石橋水廠進水。表3小灣里進水、長蕩湖湖心、西石橋水廠進水水樣各劑量組對斑馬魚胚胎96h正常孵化率（％）的影響劑量（濃縮倍數(shù)）7.812515.62531.2562.5125小灣里進水66.67±6..24**65.00±7..07**36.67±6..24**0.00**0.00**長蕩湖湖心93.33±4..7185.00±7..0781.67±100.270.00**0.00**西石橋進水85.00±144.7278.33±6..2478.33±111.7990.00±4..0838.33±288.96***空白對照87.73±9..03注：孵化率（％）以mean±SD表示；**:P<0.013討論根據(jù)2002江蘇省環(huán)境狀況公報，長江江蘇段干流水質(zhì)總體較好，水質(zhì)符合地表水環(huán)境質(zhì)量II類標準。太湖湖體水質(zhì)總體劣于Ⅴ類。長蕩湖為太湖流域第三大湖泊，目前水質(zhì)基本滿足Ⅲ類標準，且近年來在逐漸變差。從本研究可以看出，彗星試驗（包括人外周血淋巴細胞和小鼠睪丸細胞）和斑馬魚胚胎發(fā)育試驗的試驗結(jié)果均與各水源地的水質(zhì)狀況基本一致，證明上述三種試驗方法可有效地檢測水中有機污染物的生物毒性。自1988年Singh提出堿性電泳法以來，各國對彗星試驗的應用研究幾乎呈指數(shù)式增長，在遺傳毒性研究、臨床應用、DNA修復研究、環(huán)境生物監(jiān)測、人群監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛應用[9]。人血淋巴細胞是彗星試驗最常用的生物材料之一，應用也最為廣泛。Rajaguru等將人血淋巴彗星試驗應用于受污染地表水的檢測，表明其在環(huán)境評價中有良好的應用前景[10]。本實驗室曾利用其評價揚中市地表水的污染狀況[11]。本研究表明，各水樣有機濃集物對人血淋巴細胞存在遺傳毒性。研究有機污染物對小鼠的毒性可以很好地反映其對哺乳動物，特別是對人的危害狀況，從而及時地預報對人類的危害。同時，研究發(fā)現(xiàn)生殖細胞DNA的損傷可導致染色體異常、流產(chǎn)、畸形、遺傳病以及下一代對癌癥易感性的增加等[12]。而小鼠睪丸細胞易于分離，且具有一定的代謝活性作用，適于評價化合物對生殖細胞的遺傳毒性[7]。有研究表明，睪丸是有機污染物的作用靶器官，有機提取物可通過血—睪屏障。光鏡觀察顯示有機污染物對染色質(zhì)有損害[13]。本研究也表明飲用水源水中存在的有機污染物能對小鼠睪丸細胞DNA產(chǎn)生損害作用，存在遺傳毒性。同時，在其中兩個水樣高濃度組DNA損傷極為嚴重，甚至出現(xiàn)了彗星頭、尾部分離的情況，這表明水樣中污染物可能已引起睪丸細胞的凋亡，存在細胞毒性。研究也表明，與人血淋巴細胞相比，有機濃集物對小鼠睪丸細胞造成的DNA損傷更為嚴重。這可能是因為睪丸細胞DNA比人血淋巴細胞DNA對有機物更為敏感。吳坤等應用小鼠整體試驗對自來水中有機污染物潛在危害進行評價時發(fā)現(xiàn)生殖細胞比體細胞更為敏感[14]。另一方面，彗星試驗結(jié)果顯示對照組細胞DNA存在著較大損傷（相對于人血淋巴細胞彗星試驗而言），這可能也是造成其各水樣各劑量組其DNA損傷更為嚴重的原因，所以有必要改進小鼠睪丸細胞的分離和培養(yǎng)方法。在斑馬魚胚胎發(fā)育試驗中，毒理學終點的選擇主要考慮以下方面：可衡量、毒理學上明顯，以及操作的簡易性。試驗中我們選用96hr能否正常孵化作為毒理學終點。同時，在試驗中我們觀察到多種不同的發(fā)育異常，如與致死性相關(guān)的卵凝結(jié)、發(fā)育停止等，以及致畸性相關(guān)的如體軸的畸形、卵黃囊吸收遲緩和多種水腫等。這其中，在小灣里進水和長蕩湖湖心水樣的高劑量組，發(fā)育異常胚胎多數(shù)在心臟和卵黃囊部位有明顯水腫。一般而言，致畸性毒理學終點比致死終點更為敏感，有研究表明，Europeanminnow在毒作用下也顯出相似的毒理學終點[15]。因此，脊椎變形、卵黃囊吸收遲緩和水腫的形成可作為魚類早期階段對毒物的非特異性反應，值得進一步研究。在毒物暴露過程中，胚胎的卵膜具有重要作用。卵膜隨發(fā)育時間的改變以及毒物性質(zhì)的不同其通透性也有較大的變化，同時考慮到胚胎的代謝系統(tǒng)沒有發(fā)育完全，所以毒物和酶系統(tǒng)的相互作用在實驗中難以完全體現(xiàn)。在發(fā)育生物學和分子遺傳學領(lǐng)域，應用斑馬魚胚胎已有大量研究成果發(fā)表，對探討污染物的致毒機理很有幫助。這一優(yōu)勢特別有助于測定混合性工業(yè)污水的毒性，具有廣闊的發(fā)展空間。目前，發(fā)達國家還是把主要注意力放在測定新化學品的毒性方面，在污水方面的工作尚在嘗試階段，而且發(fā)展較慢。Strmac等[15],Gellert和Heinrichsdorff[16]的研究都表明斑馬魚胚胎發(fā)育試驗是合適的毒性監(jiān)測手段。而解決各種工業(yè)廢水和生活污水所造成的環(huán)境問題已經(jīng)成為我國環(huán)保事業(yè)的當務之急。本研究證明，斑馬魚胚胎發(fā)育試驗可用于對飲用水源有機物污染的監(jiān)測。參考文獻：朱惠剛.水中有機致突變物綜合評價指標探討.上海環(huán)境科學，1995,14(10):44-49RojasE，LopezMC，ValverdeM.Singlecellgelelectrophoresisassay:methodologyandapplications.JChromatogrB,1999,722:225–254朱琳，史淑潔.斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評價中的應用.應用生態(tài)學報，2002，13（2）：252-254SinghNP,McCoyMT,TiceRR,etal.AsimpletechniqueforquantitationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells.ExpCellRes,1988,175:184-191CollinsAR,MaAG,DuthieSJ.ThekineticsofrepairofoxidativeDNAdamage(strandbreaksandoxidisedpyrimidines)inhumancells.MutatRes,1995,336:69-77DevauxA,PesonenM,MonodG.Alkalinecometassayinrainbowtrouthepatocytes.ToxicolinVitro,1997,11:71~79張遵真，衡正昌，廖艷等．彗星試驗檢測間接誘變劑對小鼠睪丸細胞的DNA損傷.癌變·畸變·突變,2001,13(1):4-7OECD.F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