分子克隆實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)步驟

分子克隆實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)步驟一、常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程：?確定目的片段的基因序列以及需要插入的載體？引物設(shè)計(jì)軟件或網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物?pcr擴(kuò)增目的基因片段?pcr產(chǎn)物的回收?載體的酶切?插入片段的酶切（重組不需要酶切）引物設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增酶切連接或重組?載體與目的片段的連接或重組?連接或重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)?涂布平板?平板菌落的鑒定?陽(yáng)性克隆送測(cè)序?測(cè)序結(jié)果的分析變換識(shí)別序列比對(duì)二、分子克隆實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)步驟（含實(shí)驗(yàn)編號(hào)）：.靶基因（克隆酶-1）的PCR擴(kuò)增口以本實(shí)驗(yàn)室常用酶kod-plus-neo（toyobo）為例體系（50ul）：□10Xkodbuf5uldntp（2mm）5ul口mg2+3ulprimer11ulprimer21ultemplate50-200ngkod0.5ulDDH2O50ul程序：95℃2min98℃10s口58℃30s35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃8日.pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠的制備（編號(hào)cknesop-2）□瓊脂糖溶液的制備：稱取瓊脂糖，置于三角瓶中，加入相應(yīng)體積的tbe或Tae緩沖液，濃度為1%-1.5%，在微波爐中加熱三角瓶中，直至瓊脂糖溶解。膠板的制備：①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；②將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，安好擋板，放好梳子。在距離底板上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。③將溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z膜中，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。④室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5?1Xtae（tris-乙酸）或tbe（tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用，沒(méi)過(guò)膠面1mm以上?！?試劑盒回收的DNA片段（編號(hào)：clonesop-3）□以本實(shí)驗(yàn)室常用dna凝膠回收試劑盒（天根）為例口使用前請(qǐng)?jiān)谇逑匆篜W中加入無(wú)水乙醇。請(qǐng)參考瓶子上的標(biāo)簽了解容量?！酡僦胶獠襟E：向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500口l平衡液bl,12,000江山（~13,400乂的離心血壯，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）（2）將瓊脂糖凝膠中的單用途DNA條（盡可能去除多余部分）切入干凈的離心管中，并稱重。③向膠塊中加入等倍體積溶液pn（如果凝膠重為0.1g,其體積可視為100口l,則加入100口lpn溶液），60℃水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可繼續(xù)放置幾分鐘或再補(bǔ)加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解（若膠塊的體積過(guò)大,可事先將膠塊切成碎塊）。注：對(duì)于回收率小于300BP的小碎片，可在加入PN完全溶膠后加入1/2體積的異丙醇,以提高回收率；橡膠塊完全溶解后,最好將溶液溫度降至室溫,然后將其置于柱上,因?yàn)槲街谑覝叵戮哂泻軓?qiáng)的結(jié)合DNA的能力?！酡軐⑸弦徊剿萌芤杭尤胍粋€(gè)吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2min,12,000江山（~13,400*的離心30-60$6。，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱。@2放入收集管中。⑤向吸附柱ca2中加入600口l漂洗液pw（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000江山（~13,400*的離心30-60$6。，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱。@2放入收集管中。⑥重復(fù)操作步驟⑤?！酡邔⑽街鵆a2以12000rpm（~13400Xg）的轉(zhuǎn)速放入回收集管中，離心2min,并盡可能去除沖洗液。吸附柱Ca2在室溫下放置幾分鐘，并徹底干燥，以防止殘留的沖洗液影響下一次實(shí)驗(yàn)。⑧將吸附柱ca2放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液eb或ddh2o,室溫放置2山壯。12,0005山（~13,400乂8）離心2min收集dna溶液。□.酶消化反應(yīng)（編號(hào)clonesop-4）□以本實(shí)驗(yàn)室常用酶fastdigestrestrictionenzymes（thermo）為例雙酶切體系（若是單酶切則只用加一種酶）：十分鐘？bufferor10Xfastdigest？綠色緩沖5硫酸消化限制酶10。5—1快速消化限制酶20。5-1uldnanddh2oupto50ul酶消化系統(tǒng)攪拌均勻后，在37℃下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于30min。如果載體（2-3ug）為酶消化，則至少應(yīng)為2H。□.酶切產(chǎn)物的回收（編號(hào)clonesop-5）□我們實(shí)驗(yàn)室常用的Axygen?axyprep?以pcrcleanupkit(axygen)為例口①在pcr、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加入3個(gè)體積的bufferpcr-a（若bufferpcr-a如果小于100ul，則添加至100ul），混合均勻，轉(zhuǎn)移至制備管中，將制備管放入2ml離心管中，離心12000g，離41min，并丟棄濾液?！酡趯⒅苽涔苤没?ml離心管，加700ulbufferw2，12000g離心1min，棄濾液。③將制備管置回2ml離心管，加400ulbufferw2，12000g離心1min，棄濾液?！酡軐⒅苽涔芊呕?ml離心管中，離心120008，離心1min。將制備管放入清潔的1.5山1離心管中，靜置2min?！酡菰谥苽涔苤醒爰?5-30uleluent或ddh2o,室溫靜置1min，12000g離心1min洗脫dna。.重組反應(yīng)（編號(hào)clonesop-6）□以本實(shí)驗(yàn)室常用novorec?pcr一步定向克隆試劑盒（novoprotein）為例體系：□10X1Novorec?重組酶0.5ul線性化載體n插入片段nddh20高達(dá)10ul口注：載體與目的片段的摩爾比在1:3-1:10之間復(fù)合反應(yīng)充分混合后，將其置于37℃水浴中20至30分鐘，然后取出并置于冰上立即轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)化（編號(hào)clonesop-7）□①將大腸桿菌的活性細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，迅速放在冰上，慢慢解凍并重新包裝。②取出連接產(chǎn)品，加入分裝接收狀態(tài)，在冰上孵育25分鐘③42℃熱激90sec,置于冰上孵育2山^,加入700過(guò)，不含抗生素的lb培養(yǎng)基，180rpm37℃培養(yǎng)45min。□④以3000rpm離心^^,丟棄大部分上清液，留約50—100ul,重新懸浮沉淀物，將其滴在已添加玻璃珠的LB板（具有相應(yīng)阻力）上，并均勻涂抹玻璃珠。⑤倒出玻璃珠，將LB板置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)?！?挑克隆搖菌與菌落pcr檢測(cè)陽(yáng)性克?。ň幪?hào)clonesop-8）□①?gòu)?7℃培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)過(guò)夜的平板，用鑷子高壓滅菌后小心取出槍頭，用槍頭尖端輕輕觸摸單個(gè)克隆，然后將槍頭尖端在一個(gè)1.5mlep的管中攪拌幾次，該管中含有150ullb液體（具有相應(yīng)的阻力）和菌落PCR反應(yīng)系統(tǒng)。將帶有培養(yǎng)基的EP管在37℃220rpm下培養(yǎng)3小時(shí)。②菌落PCR：□20ul菌落pcr體系，以本實(shí)驗(yàn)室常用2Xtsingkemastermix為例：□2X10口l的混合物。5ulprimer20。5ul細(xì)菌口ddh2o9ul菌落PCR程序：□95℃3min95℃30s58℃30S30循環(huán)72℃1-2kb/min72℃5min12℃^D③瓊脂糖電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物以判定陽(yáng)性克隆口.細(xì)菌溶液的擴(kuò)大培養(yǎng)（編號(hào)：clonesop-9）□將pcr鑒定為陽(yáng)性的菌液吸取5-10U1接種至5mllb（含抗性）培養(yǎng)基中，在220rpm,37℃搖床中過(guò)夜培養(yǎng)。.小提取質(zhì)粒（編號(hào)：clonesop-10）□取出過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，對(duì)已經(jīng)混濁的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取（天根質(zhì)粒dna小提試劑盒）。①柱平衡步驟：向吸附柱cp3中（吸附柱放入收集管中）加入500口l的平衡液bl，12,0005山（~13,400*Q離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。②取5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，4500rpm離心5分鐘，盡量吸除上清，將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。③向離心管中加入200PL細(xì)菌沉淀溶液P1（已提前加入RNaseA）,并使用移液管或旋渦振蕩器完全懸浮細(xì)菌沉淀。④向離心管中加入200Hl溶液p2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6—8次使菌體充分裂解?！酡菹螂x心管中加入300口1溶液P3,立即輕輕上下轉(zhuǎn)動(dòng)6c8次，攪拌均勻。此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm（~13400*8）離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。□注意：p3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色可再次離心后取上清。⑥用移液管將上一步收集的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3（吸附柱放入收集管），注意不要盡可能多地吸出沉淀物。12000rpm（~13400*8）離心30-60秒，將收集管中的廢液倒出，將吸附柱CP3放入收集管中?！酡呦蛭街鵦p3中加入600口l漂洗液pw（事先已加入無(wú)水乙醇），12,000江山（~13,400乂的離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱。口3放入收集管中。⑧向吸附柱cp3中加入600口l漂洗液pw,12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。⑨將吸附柱CP3以12000rpm（~13400Xg）的轉(zhuǎn)速放入收集管中離心2分鐘，以去除吸附柱中殘留的沖洗液。⑩將吸附柱cp3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加80口l洗脫緩沖液0卜室溫放置2分鐘，12,000江山（~13,400*Q離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。置于4℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng).pcr實(shí)驗(yàn)請(qǐng)注意酶的擴(kuò)增效率，有的酶是1kb/min,有的是2kb/min,具體請(qǐng)查看相應(yīng)酶的說(shuō)明舒。.瓊脂糖凝膠制備過(guò)程中請(qǐng)注意污染區(qū)與非污染區(qū)，在電泳點(diǎn)樣前請(qǐng)確保樣品和dnamarker添加了核酸染料。.試劑盒使用之前檢查漂洗液是否已加入無(wú)水乙醇。常用培養(yǎng)基和緩沖液的制備：b液體培養(yǎng)基（11）配方：□10g胰蛋白胨5g酵母提取物5g氯化鈉口用去離子水定容至11,高壓蒸汽滅菌20分鐘。2.1b液體培養(yǎng)基（11）配方：□10g胰蛋白胨5g酵母提取物5g氯化鈉口15g瓊脂粉口用去離子水定容至1L,用高壓蒸汽消毒20分鐘。3.TB液體介質(zhì)（1L）配方：□將下列組分溶解在0.91水中：蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60℃,再加100ml滅菌的170mmo1/1kh2po4/0.72mo1/1k2hpo4的溶液（2.31g的kh2po4和12.54gk2hpo4溶