分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用與前景

..分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的臨床應(yīng)用及前景__2013級(jí)科碩6班專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)__姜世濤評(píng)分：導(dǎo)師簽名：分子生物學(xué)是一門正在蓬勃發(fā)展的學(xué)科,新技術(shù)和應(yīng)用條件的不斷出現(xiàn),為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了嶄新的時(shí)代并提供新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。分子生物學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為研究對象的學(xué)科,分子生物學(xué)技術(shù)即建立在核酸生化基礎(chǔ)上的一類研究手段,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中,同時(shí)也逐漸滲入數(shù)理科學(xué)、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和環(huán)境基因組學(xué),研究內(nèi)容也從DNA鑒定、擴(kuò)展到核酸及表達(dá)產(chǎn)物分析,技術(shù)不斷進(jìn)步為微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、兔疫系統(tǒng)疾病診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路。在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)蓬勃發(fā)展形勢下,分子診斷學(xué)技術(shù)將會(huì)取得突破性進(jìn)展。一．利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測樣品中核酸水平PCR[1]技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛和成熟的臨床檢測方法,在法醫(yī)學(xué)、常見傳染病、性病、寄生蟲和優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域有很高的應(yīng)用價(jià)值,尤其對肝炎病毒的早期診斷。1．核酸分子雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)也稱為基因探針技術(shù),利用核酸的變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對的原理,用已知的探針序列檢測樣本中是否含有與之配對的核苷酸序列的技術(shù),是印跡雜交、基因芯片等技術(shù)的基礎(chǔ)。目前基因芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用在腫瘤基因表達(dá)譜差異研究、基因突變、基因測序、基因多態(tài)性分析、微生物篩選鑒定、遺傳病產(chǎn)前診斷等方面。另外,現(xiàn)已獲得一些微生物的全基因序列,包括百余種病毒,多種細(xì)菌<流感嗜血桿菌、產(chǎn)甲烷球菌及實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌等>和一些酵母等。因此,將一種或多種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在一塊基因芯片上,可快速、簡便地檢測出病原體,判斷侵入機(jī)體引起感染性疾病的病原微生物<病毒、細(xì)菌或寄生蟲等>,從而對疾病作出診斷及鑒別診斷。2．單核苷酸多態(tài)性分析<SNP>技術(shù)在人群中,個(gè)體基因的核苷酸序列存在差異性,稱為基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)普遍存在于人的基因組中。如果在某個(gè)家庭中,某一致病基因與特定的多態(tài)性片段緊密連鎖,就可以用這一多態(tài)性片段作為一種"遺傳標(biāo)記"來判斷家庭成員或胎兒是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性是個(gè)體的"身份證",因此,基因多態(tài)性分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究、疾病連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析、疾病遺傳機(jī)制研究、腫瘤易感性研究、個(gè)性化用藥等諸多方面。單核苷酸多態(tài)性<singlenucleotidepolymorphism,SNP>分析技術(shù)為臨床檢測提供了依據(jù)。SNP是一種最常見的遺傳變異,在人類DNA多態(tài)性中,SNP約占90％。SNP是指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基。SNP與RFLP和STR等DNA標(biāo)記的主要不同在于：它不再以"長度"的差異作為檢測手段,而是直接以序列的差異作為標(biāo)記。由于SNP是二態(tài)的,易于自動(dòng)化批量檢測,易于計(jì)算機(jī)分析結(jié)果,因此SNP檢測已廣泛地應(yīng)用于疾病的連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機(jī)制研究、個(gè)性化用藥研究等諸多領(lǐng)域。盡管SNP檢測在搜尋疾病基因方面有潛在的價(jià)值,但實(shí)際應(yīng)用中卻比人們想象的要難得多,它需要花費(fèi)大量的時(shí)間進(jìn)行篩查,才能建立可靠的SNP分析圖譜。3．microRNA是潛在的臨床診斷工具microRNAs<miRNAs>是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs,其功能是負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。在正常組織中,miRNA轉(zhuǎn)錄,加工,結(jié)合到靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn),通過抑制蛋白翻譯或是改變mRNA的穩(wěn)定性來抑制基因表達(dá),維持細(xì)胞生長、增殖、分化和死亡的正常進(jìn)行。不同miRNA的分布有組織特異性,因此在生理和病理?xiàng)l件下,miRNA的表達(dá)水平存在差異。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步驟的缺陷造成的,而這最終將導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)膍iRNA的靶蛋白的表達(dá)。最后的結(jié)果可能導(dǎo)致過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或者去分化,引起腫瘤的形成。最近的證據(jù)表明,miRNA突變或者異位表達(dá)與多種人類癌癥相關(guān),miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中,大約50％在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn),這說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起了至關(guān)重要的作用。例如,mir-125b一1,線蟲lin一4的同源基因,在染色體的1lq24脆性位點(diǎn),在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌病人中有缺失。若能確定多種腫瘤的miRNA表達(dá)譜特征庫,可以幫助診斷和治療腫瘤。由于miRNAs可以從福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中分離出來,這使得miRNA表達(dá)譜特征庫建立成為可能。在此基礎(chǔ)上,用特定的miRNAs表達(dá)差異圖譜,還可以用于預(yù)測病人的預(yù)后。另外從治療的角度,miRNA表達(dá)譜可能為臨床上確定一個(gè)治療方案提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。二、蛋白組學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用隨著生物體全基因組序列的解析,特別是人類基因組序列草圖的完成,基因組學(xué)研究重點(diǎn)不可避免地從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué),因此在上世紀(jì)90年代中期,蛋白質(zhì)組學(xué)正研究成為基礎(chǔ)研究的重要支柱。蛋白組學(xué)是在基因組學(xué)之后又一組學(xué),其發(fā)展之迅速,是由于其能夠較為全面的考察蛋白層面的表達(dá)情況,有利于獲得各種蛋白、多肽因子等信息從而對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體,從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律。與基因組相比蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性,雖然可以通過PCR、基因芯片等方法顯示生物體的基因水平,但mRNA水平<包括mRNA的種類和含量>并不能完全反映出蛋白質(zhì)的表達(dá)。由此可見,對一個(gè)機(jī)體而言,基因的數(shù)目是恒定的,而蛋白質(zhì)的種類和數(shù)目在生理和病理等不同條件下,其表達(dá)也不同。若能獲得與某種疾病相關(guān)的蛋白水平的差異表達(dá)信息,將為臨床診斷、治療和預(yù)后提供有力依據(jù)。1．蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新的方法,它類似于基因芯片,是將蛋白質(zhì)點(diǎn)到固相物質(zhì)上,然后與要檢測的組織或細(xì)胞等進(jìn)行"雜交",再通過自動(dòng)化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的"雜交"是指蛋白與蛋白之間如<抗體與抗原>在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別。例如免疫芯片,是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片,它在臨床分子診斷學(xué)有著明顯的發(fā)展?jié)摿?如腫瘤標(biāo)志的檢測、不同激素的測定,自身免疫性疾病中多種自身抗體或抗原的檢測和超敏反應(yīng)中多種過敏原的篩查等。2．液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用根據(jù)探針標(biāo)記和色譜分析的原理,液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜主要由兩部分組成：磁珠部分即液體芯片部分；飛行時(shí)間質(zhì)譜儀部分,用于獲取磁珠捕獲的蛋白質(zhì)質(zhì)量和含量,根據(jù)不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)在長度一定的真空管中飛行所需時(shí)間不同,被測定的蛋白質(zhì)以一系列波鋒的形式出現(xiàn),并由此繪制出待測蛋白的質(zhì)譜圖,可發(fā)現(xiàn)各樣本間的蛋白質(zhì)表達(dá)和含量的異同。液體芯片一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽,經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜測定和軟件分析,建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模型,用于預(yù)測未知樣品的歸屬。液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)主要用于從復(fù)雜體液如血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液、組織裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。一方面,該技術(shù)能夠在生物液體中檢測指示特異疾病的生物標(biāo)志物模式或生物標(biāo)志物譜,另一方面,該技術(shù)還可以鑒定單個(gè)的生物標(biāo)志物候選物。在哈佛大學(xué)女子醫(yī)院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、麻省總醫(yī)院、貝勒醫(yī)學(xué)院等世界一流醫(yī)院和醫(yī)學(xué)研究所中,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、膀胱癌等的早期診斷研究中。應(yīng)用該技術(shù)可協(xié)助診斷多種遺傳性代謝紊亂疾病,如各種氨基酸代謝失常血癥,包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥和各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥和其他各種有機(jī)酸代謝失常疾病等。由于液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、快速、高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、分辨率高、檢測費(fèi)用低等特點(diǎn),是極具潛力的臨床腫瘤早期診斷工具。三．分子生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用隨著人類基因組計(jì)劃<HGP>的完成,蛋白質(zhì)組計(jì)劃也已經(jīng)啟動(dòng),基因序列數(shù)據(jù)、蛋白序列和功能數(shù)據(jù)以驚人的速度增長,而傳統(tǒng)的生物技術(shù)已經(jīng)不能滿足數(shù)據(jù)倍增的要求,生命科學(xué)需要更快捷、更準(zhǔn)確的自動(dòng)化的生物技術(shù),而生物芯片在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片<biochip>的概念雖源于計(jì)算機(jī)芯片但不同于計(jì)算機(jī)芯片。狹義的生物芯片即微陣列芯片,主要包括cDNA微陣列、寡核昔酸微陣列、蛋白質(zhì)微陣列和小分子化合物微陣列。分析的基本單位是在一定尺寸的基片<如硅片、玻璃、塑料等>表面以點(diǎn)陣方式固定的一系列可尋找的識(shí)別分子,點(diǎn)陣中每一個(gè)點(diǎn)都可視為一個(gè)傳感器的探頭。芯片表面固定的分子在一定的條件下與被檢測物進(jìn)行反應(yīng),其結(jié)果利用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法、同位素法或電化學(xué)法顯示,再用掃描儀等儀器記錄,最后通過專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。而廣義的生物芯片是指能對生物成分或生物分子進(jìn)行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件。生物芯片技術(shù)是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù),具有重大的基礎(chǔ)研究價(jià)值,又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。經(jīng)過十多年發(fā)展,生物芯片技術(shù)已日臻完善,其應(yīng)用前景非常廣闊,因其具有技術(shù)操作簡易、自動(dòng)化程度高、檢測目的分子數(shù)量多、高通量等特點(diǎn),為"基因組計(jì)劃"時(shí)期基因功能的研究及科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面,生物芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于病毒、細(xì)茵的檢測自身兔疫性疾病的兔疫標(biāo)志物的檢測。遺傳性疾病的檢測及腫瘤免疫標(biāo)志物的單一檢測及其聯(lián)檢等方面。甘志遠(yuǎn)等[3]通過呼吸道斑點(diǎn)試驗(yàn)芯片法檢測呼吸道病毒抗體具有簡便快速、靈敏度和特異度高等優(yōu)點(diǎn),是臨床呼吸道病毒感染輔助診斷的有效方法。值得推廣使用生物芯片具有操作簡單、信息量大、節(jié)約試劑、減少誤差、診斷快速的特點(diǎn)。在臨床診斷、科學(xué)研究和流行病學(xué)篩選中具有廣泛的應(yīng)用前景,它的的誕生也為人們提供了一種高通量、高效率的腫瘤學(xué)研究手段[4-6]。五．分子生物納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用1.納米科學(xué)技術(shù)是20世紀(jì)末期剛剛誕生并正在崛起的新科技。通過直接操縱和安排原子、分子創(chuàng)制新物質(zhì),納米技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合,促進(jìn)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的完善、臨床診斷技術(shù)的革新及治療水平的提高[7]。通過應(yīng)用納米技術(shù),在DNA檢測時(shí),檢測方法更加簡便、快速、準(zhǔn)確。美國NASAAmesCenterforNanoteChnology與中南大學(xué)衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作,將碳納米管用于基因芯片,樣本需要量低于1000個(gè)NDA分子〔傳統(tǒng)DNA檢測的樣本需要量超過106個(gè)DNA分子；需要的樣品量更少,可免去傳統(tǒng)的PcR擴(kuò)增步驟；結(jié)果可靠、重復(fù)性好、操作簡單、易實(shí)現(xiàn)檢測自動(dòng)化[8]。免疫分析加上磁性修飾已成功地用于各種生物活性物質(zhì)和異生質(zhì),如藥物、致癌物等的檢測。將特異性抗體或抗原固定到納米磁球表面,并以酶、放射性同位素?zé)晒馊玖匣蚧瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)為基礎(chǔ)所產(chǎn)生的檢測與傳統(tǒng)微量滴定板技術(shù)相比具有簡單、快速和靈敏的特點(diǎn)?；裘揽〉萚9]利用抗體偶聯(lián)的靶向磁性納米顆粒,同時(shí)具有可在病毒感染的細(xì)胞周圍特異性富集和磁顆?？稍诮蛔兇艌鱿赂袘?yīng)升溫的雙重功能,將其作為磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì),有望研制出病毒感染性疾病磁感應(yīng)熱療的靶向介質(zhì)。為尋求一條快速診斷EV71病毒感染的新方法,納米細(xì)胞分離技術(shù)的出現(xiàn)有助于解決生物醫(yī)學(xué)中快速獲取細(xì)胞標(biāo)本的難題。應(yīng)用納米免疫磁珠檢測早期肺癌患者循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞,可監(jiān)測肺癌的轉(zhuǎn)移情況。2.六．分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢測應(yīng)用中的問題疾病的發(fā)生是由于人體受內(nèi)外因素的影響,導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞、組織或器官功能紊亂,歸根到底是核酸、蛋白等分子水平表達(dá)異常,由此可見,利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床檢測是協(xié)助臨床診斷和治療的必不可少的工具。但由于分子生物學(xué)技術(shù)不僅對臨床樣品的處理有較高要求,而且對檢測人員的技術(shù)水平也有要求,這就涉及到從標(biāo)本收集、處理、檢測和分析等多個(gè)環(huán)節(jié)的系統(tǒng)化和規(guī)范化,為此,我國已制定了臨床實(shí)驗(yàn)室定量測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南。利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行臨床監(jiān)測,在某些情況下可能存在一定困難,例如與核酸相比,蛋白和多肽作為生物標(biāo)志的一個(gè)優(yōu)勢是它們能夠很容易的在血液、尿液和其他生物體液中找到。這些類型的樣品很容易獲得,并代表了含有豐富的具有潛在信息的生物學(xué)信息分子。但從研究手段方面來說,蛋白質(zhì)研究技術(shù)比核酸技術(shù)相對要復(fù)雜和困難,不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基,而且在蛋白質(zhì)組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴(kuò)增目的片段,這樣對于豐度低但功能重要的蛋白質(zhì)很難進(jìn)行大規(guī)模的研究。miRNA雖然是新興的研究領(lǐng)域,但它們與疾病的相關(guān)性日益受到人們的重視,相信隨著基礎(chǔ)研究對miRNA不斷深入的認(rèn)識(shí),miRNA必將成為臨床檢測中的手段之一。七．參考文獻(xiàn)[1]王海英.分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用發(fā)展［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)2011,17〔616.[2]解福生,李歡.蛋白組學(xué)在心血管方面的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)信息<中旬刊>,2011,8,3812-3813.[3]甘志遠(yuǎn),顏云盈,朱心智.生物芯片在嬰幼兒呼吸道病原體感染診斷中的應(yīng)用[J].內(nèi)科,2011,6<3>:215-216.[4]王新允,袁玲,鄭海燕等.肺癌中FHIT蛋白表達(dá)細(xì)胞芯片的研究[J].中國肺癌雜志,2009,12<2>:131-134.[5]朱抿,于軍,周文利