生物信息學(xué)-第4次理論蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)背景基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性VS生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性從genomic到proteome對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研究已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和重要任務(wù)。Theeraof‘omics’-basedscienceGenomics（基因組學(xué)）Post-genomicscience（后基因組時(shí)代）Functionalgenomics（功能基因組學(xué)）Transcriptomics（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）Proteomics（蛋白質(zhì)組學(xué)）Metabolomics（代謝組學(xué)）Structuralgenomics（結(jié)構(gòu)基因組學(xué)）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!

第一節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及發(fā)展進(jìn)展第二節(jié)蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法第三節(jié)蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法

主要內(nèi)容

第一節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及發(fā)展進(jìn)展

蛋白質(zhì)組（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)）。1994年由Williams和Wilkins提出，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，指的是不同細(xì)胞在不同時(shí)相表達(dá)不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)的概念對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

主要研究?jī)?nèi)容

了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；

明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；

描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。

表達(dá)蛋白組學(xué)ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白質(zhì)組功能模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白質(zhì)組研究包括兩個(gè)方面：

基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified功能蛋白質(zhì)組學(xué)

(functionalproteomics)的提出

功能蛋白質(zhì)組：細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。介于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)之間。

從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個(gè)功能亞群體。將多個(gè)亞群體組合起來(lái)，逐步描繪出接近于生命細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。發(fā)展進(jìn)展各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1000萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測(cè)序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。

Celera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作。

1997年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議

1998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議

1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議

我國(guó)也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)

2003成立了中國(guó)人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，2004年10月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。

科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。第二節(jié)蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法研究蛋白質(zhì)組組成成分、差異和功能主要研究目標(biāo)（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備

通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等

樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度。組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備

臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤中癌變的上皮類細(xì)胞總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。

（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。特點(diǎn)可分離10～100kD分子量的蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配2-DE技術(shù)的缺點(diǎn)

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。新型非凝膠技術(shù)

液相色譜法liquidchromatography，LC毛細(xì)管電泳capillaryelectrophoresis，CE

（三）常見(jiàn)蛋白質(zhì)顯色技術(shù)

考馬斯亮藍(lán)染色

常見(jiàn)顯色方法比較考染和銀染的比較有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無(wú)背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過(guò)SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。（四）凝膠的圖像處理分析和膠內(nèi)酶切凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：目前有多種圖像分析軟件可用于膠的圖像分析:

MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinum這些軟件可以完成蛋白質(zhì)點(diǎn)的識(shí)別、匹配等，具有很強(qiáng)的分析功能，但其缺點(diǎn)是需要很多的圖像手工校對(duì)，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組雙向電泳差異表達(dá)譜園點(diǎn)標(biāo)記的點(diǎn)為兩者的差異蛋白數(shù)字號(hào)碼為蛋白質(zhì)點(diǎn)在參考膠中的索引號(hào)蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切

包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過(guò)程（五）質(zhì)譜分析樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比（m/z）的差異來(lái)分離并確定分子量定性定量質(zhì)譜m/z離子化原理質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的一種分析方法。20世紀(jì)初20世紀(jì)40年代20世紀(jì)60年代20世紀(jì)80年代J.J.Thomson制成第一臺(tái)質(zhì)譜儀主要是用來(lái)進(jìn)行同位素測(cè)定和無(wú)機(jī)元素分析開(kāi)始用于有機(jī)物分析出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀成為有機(jī)物分析的重要儀器質(zhì)譜新技術(shù)：電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)電離源液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展過(guò)程SirJosephJohnThomson-1906年諾貝爾物理獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：氣態(tài)下離子導(dǎo)電的理論和實(shí)驗(yàn)探索

FrederickSoddy-1921年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使我們對(duì)放射活性物質(zhì)的認(rèn)識(shí)大大提高，另外他對(duì)同位素的起源和性質(zhì)也作了出色工作。

FrancisWilliamAston-1922年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使用質(zhì)譜方法大規(guī)模的研究非放射性元素的同位素；提出整數(shù)規(guī)則。

HansG.DehmeltandWolfgangPaul-1989年同獲諾貝爾物理獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：開(kāi)發(fā)了離子阱質(zhì)譜技術(shù)。

RobertF.CurlJr.&SirHaroldW.Kroto&RichardE.Smalley-1996年分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使用質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)富洛倫尼斯（C60-C80，足球烯）

JohnFennandKoichiTanakawithKurtWuthrich-2002年分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：發(fā)展了可用于分析生物大分子的軟電離方法。質(zhì)譜相關(guān)工作的成就進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器數(shù)據(jù)采集及分析真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀模塊組成真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個(gè)特點(diǎn)，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。由機(jī)械真空泵(前極低真空泵)，擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。在不破壞真空度的情況下，使樣品進(jìn)入離子源。氣體可通過(guò)儲(chǔ)氣器進(jìn)入離子源。易揮發(fā)的液體，在進(jìn)樣系統(tǒng)內(nèi)汽化后進(jìn)入離子源。難揮發(fā)的液體或固體樣品，通過(guò)探針直接插入離子源。進(jìn)樣系統(tǒng)分子失去電子，生成帶正電荷的分子離子

分子離子可進(jìn)一步裂解，生成質(zhì)量更小的碎片離子

M+eM+.+2eM-.

小于1%M+.A+.++B+CD++.

中性分子或碎片R.50-70eV離子源離子源（Ionsource）質(zhì)譜儀的離子源種類主要有：化學(xué)電離源(ChemicalIonization,CI)快原子轟擊源（FastAtomicbombardment,FAB）

電噴霧源(ElectronsprayIonization，ESI)大氣壓化學(xué)電離源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)大氣壓光學(xué)電離源（Atmosphericpressurephotoionization,APPI）基質(zhì)輔助的激光解吸電離源（MALDI-TOF）電子電離源(ElectronIonizationEI)

每一種電離方法都有一定的分子量檢測(cè)范圍

EI/CIESI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVeryPolarNonpolar電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期的兩項(xiàng)軌電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在pmol的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的生物大分子成為可能，并得到迅速的發(fā)展。被稱做是“軟”電離技術(shù)，因?yàn)椋核麄冊(cè)陔x子化過(guò)程中不會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，能實(shí)現(xiàn)分子量大于10,000質(zhì)量單位的生物大分子的質(zhì)量分析電噴霧源(ESI)待測(cè)分子溶解在溶劑中，以液相方式通過(guò)毛細(xì)管到達(dá)噴口。在噴口高電壓作用下形成帶電荷的微滴，隨著微滴中的揮發(fā)性溶劑蒸發(fā)，微滴表面的電場(chǎng)隨半徑減少而增加，到達(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)，樣品將以離子方式從液滴表面蒸發(fā)，進(jìn)入氣相。這一過(guò)程即實(shí)現(xiàn)了樣品的離子化，沒(méi)有直接的外界能量作用于分子，因此對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式。其他特點(diǎn)

可形成多電荷離子，因此在較小的m/z范圍內(nèi)可以檢測(cè)到大分子質(zhì)量的分子。采用電噴霧質(zhì)譜目前可測(cè)定分子質(zhì)量100kDa以下的蛋白質(zhì)，最高可達(dá)150kDa。由于離子蒸發(fā)使電噴霧質(zhì)譜采用液相方式進(jìn)樣，因此可與蛋白質(zhì)化學(xué)中常用的液相色譜聯(lián)用，即液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESIMS)，蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)過(guò)高效液相色譜分離后，直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定。在常規(guī)電噴霧質(zhì)譜中，噴霧的過(guò)程易形成較大液滴，液滴中的樣品分子在離子源就不能完全離子化，從而降低了樣品的利用率和靈敏度?；|(zhì)輔助激光解析電離是利用固體基質(zhì)分子均勻的包埋樣品分子，在激光的照射下，基質(zhì)分子吸收激光能量而蒸發(fā)，攜帶樣品分子進(jìn)入氣相，進(jìn)一步將能量傳遞給樣品分子，從而實(shí)現(xiàn)樣品分子離子化。由于樣品的電離過(guò)程是由基質(zhì)介導(dǎo)的，因此基質(zhì)的選擇對(duì)分子離子化有很大的影響,繼而影響到分析的靈敏度、分辨率和精確度。合適的基質(zhì)應(yīng)該是保證待測(cè)物的離子化，而且基質(zhì)本身的離子造成的背景較弱。MALDI最大的特點(diǎn)是離子電荷通常為1-2個(gè)，而不象ESI中為多電荷離子，對(duì)分子質(zhì)量較大的樣品而言，不會(huì)形成復(fù)雜的多電荷圖譜，因而對(duì)圖譜的解析比較清楚。質(zhì)量分析器(Massanalyzer)

是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開(kāi)的部分,離子通過(guò)分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開(kāi),將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。種類：磁式單聚焦分析器磁式雙聚焦分析器四極桿分析器離子阱分析器飛行時(shí)間分析器回旋共振分析器串接/聯(lián)用……飛行時(shí)間分析器

（TimeofFlightMS,TOF-MS）

TOF-MS的核心部分是一個(gè)無(wú)場(chǎng)的離子漂移管

加速后的離子具有相同的動(dòng)能

m/z小的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度快，最先通過(guò)漂移管，到達(dá)檢測(cè)器。

m/z大的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度慢，最后通過(guò)漂移管，到達(dá)檢測(cè)器。

檢測(cè)通過(guò)漂移管的時(shí)間(t)及其相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度，可得到質(zhì)譜圖，t為或s數(shù)量級(jí)。

適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分辨率隨m/z的增大而降低。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器檢測(cè)器接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板橫坐標(biāo)為離子的質(zhì)核比，縱坐標(biāo)為離子相對(duì)強(qiáng)度或相對(duì)豐度。乙醇的如下：質(zhì)譜圖InletIonizationMassAnalyzerMassSorting(filtering)IonDetectorDetectionIonSource? Solid? Liquid? VaporDetectionsFormions(chargedmolecules)SortIonsbyMass(m/z)1330134013501007550250MassSpectrum總結(jié)：獲得質(zhì)譜流程（六）蛋白質(zhì)序列測(cè)定主要有兩種方法：數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(Sequencedatabasesearch):

從頭算法(Denovointerpretation)兩種方法各自的特點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法將實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜與由數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽序列得到的理論質(zhì)譜相關(guān)聯(lián),得到候選肽序列,它對(duì)質(zhì)譜質(zhì)量要求不高,能夠鑒定復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品,前提是待鑒定蛋白質(zhì)樣品的序列存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中.從頭算法利用實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜中譜峰之間的質(zhì)量差直接計(jì)算出肽序列,不需要數(shù)據(jù)庫(kù)的輔助,能夠鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在的新序列,但是它需要相對(duì)高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索原理1、根據(jù)蛋白質(zhì)被酶解的特異性位點(diǎn)(如胰蛋白酶在氨基酸K和R的C端切斷蛋白質(zhì)鏈)、遺漏位點(diǎn)數(shù)(肽段上沒(méi)有被切斷的特異性位點(diǎn)數(shù))等參數(shù)模擬酶解從數(shù)據(jù)庫(kù)中讀出的蛋白質(zhì)序列,形成理論肽;2、根據(jù)質(zhì)譜儀種類、肽的理化性質(zhì)、翻譯后修飾等參數(shù)模擬肽在質(zhì)譜儀中碎裂的模式對(duì)每個(gè)理論肽進(jìn)行碎裂,生成理論碎片離子,每個(gè)理論肽對(duì)應(yīng)的所有碎片離子的質(zhì)荷比及其預(yù)測(cè)強(qiáng)度構(gòu)成理論串聯(lián)質(zhì)譜；

3、將理論串聯(lián)質(zhì)譜與實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜用某種評(píng)價(jià)體系(打分方法)相關(guān)聯(lián),得到候選肽的列表；4、最后對(duì)候選肽進(jìn)行驗(yàn)證和分組就將可能的蛋白質(zhì)鑒定出來(lái).這種方法的核心是肽鑒定打分算法和理論串聯(lián)質(zhì)譜的預(yù)測(cè)模型。一些典型的打分算法基于概率的打分算法

Mascot、SCOPE、ProbID、OLAV采用基于概率的肽打分算法.Mascot通過(guò)考慮肽長(zhǎng)度、遺漏酶切位點(diǎn)、離子質(zhì)荷比誤差以及離子強(qiáng)度等因素,計(jì)算實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜與理論串聯(lián)質(zhì)譜間的匹配作為一次隨機(jī)事件的發(fā)生概率P,

對(duì)這些得分進(jìn)行顯著性評(píng)價(jià)得到最終的肽鑒定結(jié)果.這種評(píng)價(jià)方法的不足在于顯著性的高低與數(shù)據(jù)庫(kù)大小相關(guān),不具客觀性.SCOPE和ProbID都是利用貝葉斯定理計(jì)算候選肽生成實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜的后驗(yàn)概率.OLAV則基于貝葉斯定理利用信號(hào)檢測(cè)理論中的對(duì)數(shù)似然比來(lái)分辨真假匹配.基于譜向量點(diǎn)積(spectraldotproduct)的打分算法瑞士的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)MascotSearchEngineMascotMS/MSIonsSearch第三節(jié)蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。

主要研究目標(biāo)

（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究翻譯后修飾糖基化乙?；谆然蜴I（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)生命的基本過(guò)程是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用新陳代謝以蛋白質(zhì)復(fù)合體或多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原體感染和免疫反應(yīng)1989年Field和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計(jì)的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)為基礎(chǔ)的。1．酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）

轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的特點(diǎn)N端含NLS和與酵母GAL1基因啟動(dòng)子上游激活序列(UASG)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域C端含GAL1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域功能上相互獨(dú)立又互相依賴，只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性系統(tǒng)構(gòu)建分別構(gòu)建含GAL4BD和AD的兩個(gè)酵母融合蛋白表達(dá)載體；建立含特殊基因型、適用于雙雜交體分析的酵母菌株

酵母雙雜交技術(shù)的基本原理主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系篩選cDNA文庫(kù)真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況不需分離靶蛋白敏感性高缺點(diǎn)1.假陽(yáng)性結(jié)果2.假陽(yáng)性結(jié)果3.限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用

2．基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法靶蛋白制備

蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化

蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定基本步驟：（1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

基本原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。

先決條件得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait）獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì)主要優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質(zhì)與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會(huì)均等

檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間的相互作用

（2）免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)