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實驗六：奶粉中可溶性蛋白質的測定

（考馬斯亮藍G-250法）1.實驗目的（1）學習考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理。（2）掌握考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的實驗技術2．實驗原理

考馬斯亮藍G-250以兩種不同顏色存在，紅色與藍色，該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{色，蛋白質-色素絡合物在595nm波長下有最大光吸收。其吸光值與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。3.實驗材料、儀器與試劑材料：奶粉儀器：可見分光光度計，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度試管。試劑：考馬斯亮藍G-250，無水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。試劑配制：考馬斯亮藍G-250試劑：稱取0.1000g考馬斯亮藍G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入85%磷酸100mL，用蒸餾水定容至1000mL。需要過濾標準蛋白質溶液（100μg/mL）：稱取100mg牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸餾水中。制成100μg/mL貯備液。按下表配成不同蛋白濃度標準液。P424.實驗步驟（1）樣品溶液制備：稱20g奶粉，定容至1000ml.稀釋：5X,10X,20X(表一組用）50X,100X,500X(表二組用）

（2）標準曲線的繪制P43①100-1000μg/mL蛋白標準曲線：②0-100μg/mL蛋白標準曲線：

取6支10mL具塞試管，按P42表各濃度蛋白標準液0.1ml，向各管中加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液，，搖勻，放置2min后于595nm波長下比色?？瞻滓哉麴s水代替標準液，其他操作同上。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。（3）樣品的測定

樣品中蛋白質濃度的測定除加入標準溶液改為樣品液外，其余操作完全相同。5.數(shù)據(jù)處理通過標準曲線回歸方程即可求得每毫升溶液中蛋白質的含量。6.注意事項（1）考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合，反應快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。

（2）考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定。

考馬斯亮藍R-250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但可以被洗脫下去，所以可用來對電泳條帶染色。（3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用玻璃比色皿，使用后

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