chapter 05 基因工程操作的主要技術(shù)

第五章基因工程操作的主要技術(shù)及原理

MainTechniquesandprinciples

inGenemanipulation

第一節(jié)核酸的提取與純化基因工程中操作的主要對(duì)象是？DNADNA通常包括那些？基因組DNA、質(zhì)粒DNA提取基因組DNA做什么用？4-2提取質(zhì)粒DNA做什么用？獲得目的基因構(gòu)建基因組文庫(kù)Southern雜交用于克隆目的基因的載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定分析限制性核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）4-34-4由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿裂解法。第一節(jié)核酸的提取與純化4-5

4-6大腸桿菌基因組DNA4-75.1.1質(zhì)粒DNA的提取4-8plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA4-91.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理DNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性4-10染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性4-11（2）所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。⑤NaAc-HAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。4-14⑦RNaseA降解RNA。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。4-15蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨酚-氯仿選用4-16（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI

的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA4-17第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性溶液II

破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）4-18上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA4-192.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素最重要的是：菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片段。4-20（2）質(zhì)?？截悢?shù)這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。4-21若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.124-225.1.2基因組DNA的提取一般過(guò)程及原理：1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!4-23（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。4-242.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎4-250.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）DNA提取用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。蛋白酶K：使膜蛋白降解,使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)降解,使DNA充分游離.SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNaseA。用2倍體積的無(wú)水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）4-263.從植物組織中制備DNA一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K。65oC溫育。4-27用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）DNA提取用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。4-284.DNA的定量和純度測(cè)定1.紫外光譜法DNA（或RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰1OD260相當(dāng)于dsDNA50ug/ml，ssDNA33ug/ml和ssRNA40ug/ml。4-294-30溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。2.凝膠電泳估計(jì)4-312DNA分子量的估計(jì)一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。MarkerMarker4-321.帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。2.電泳遷移率同電場(chǎng)的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。3.電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。5.2.1電泳的基本原理第二節(jié)DNA的凝膠電泳4-334.摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動(dòng)越慢。5.4-34RelaxedsupercoiledIncreasingdegreeofsupercoiling相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開(kāi)環(huán)狀最慢。4-354-364-375.2.2瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高空隙小4-383.瓊脂糖凝膠的分辨力瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片段大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過(guò)，而大分子難通過(guò)；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過(guò)?？障洞笮Q定其分辨分子大小的能力。4-395.2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片段大?。╞p）4.010.020.01000—100500—2550—1瓊脂糖凝膠電泳：1000—50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1—1000bp4-405.2.4凝膠染色1.染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）4-412.原理EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。4-42

4-43UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)4-44OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)4-45核酸分子雜交：具有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。第三節(jié)核酸的分子雜交

4-465.3.1Southernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。4-474-48Southernblot篩選結(jié)果4-495.3.2Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。4-505.3.3Westernblot用特定的一抗和二抗檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品。4-51基因擴(kuò)增（geneamplification)指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有兩種方式：PCR擴(kuò)增

基因工程擴(kuò)增第四節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)4-52PCR擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。

基因工程擴(kuò)增載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。4-53PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，體外特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。Mullis,K.B.(1993)Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.262(4)56-65.1983年Cetus公司的科學(xué)家Kary.B.Mullis，1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。5.4.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

4-544-551.PCR技術(shù)的原理模板DNA變性

94oC引物DNA復(fù)性

55oC引物DNA延伸

72oC4-56（1）DNA模板變性雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開(kāi)成為單鏈。92~94oCTGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA模板模板（template）92~94oC4-57（2）DNA模板與引物復(fù)性人工合成的單鏈DNA小片段，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5‘端相同。TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oC4-58（3）DNA鏈的延伸DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。72oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’模板ACGTACGTA5’Taq5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板ATCTTGAAC5’Taq4-59（5）新一輪循環(huán)開(kāi)始理論上25-30次循環(huán)就可以合成225-230條DNA。變性—復(fù)性—延伸。（4）1個(gè)循環(huán)的結(jié)果4-60（1）模板（template)但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②模板的量：不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。①純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。2.PCR體系的主要成分4-61（2）引物（primer)與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（5‘端相同）的短DNA。①位置3’3’4-62②引物的長(zhǎng)度即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約2×10-11）。理論計(jì)算：419=2.751011。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)15—30bp。4-63③引物的堿基序列5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3’端必須與模板正確配對(duì)，5’端可以不配對(duì)。templateprimer4-64④引物的堿基組成盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）4-653）避免形成引物二聚體（dimer）兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer24-66⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時(shí)，復(fù)性溫度低于55oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計(jì)算：一般估計(jì)：4-67⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。⑦簡(jiǎn)并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。4-68⑧套嵌引物（nestedprimers)設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件1324如Primer5.0等4-69Primer5.04-70（3）dNTPs

dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱。一般反應(yīng)體系中dNTP混合液終濃度用0.2mmol/L。濃度過(guò)高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率。4-71自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（4）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。①熱穩(wěn)定性4-72②最適溫度最適溫度：75-80oC延伸速度：約35-150nt/s.酶分子最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kb③Taq酶的功能缺點(diǎn)具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒(méi)有3‘5’外切酶活性。因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。4-73④TaqDNA聚合酶的激活劑金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4-74（2）其它耐熱的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶無(wú)3’5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴(kuò)增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受100oC高溫。4-75③

PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR產(chǎn)物為平端！

是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯(cuò)率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR產(chǎn)物3’端往往帶有一個(gè)A。4-76（6）Mg2+

的濃度TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+

。所以Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2終濃度。4-773.PCR的條件（1）第一步變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步復(fù)性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。4-78（3）第三步延伸（extend）94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（5）第五步重復(fù)（repeat）4-79溫度循環(huán)第二步——第三步——第四步復(fù)性延伸變性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min4-804-814.PCR的特點(diǎn)需要的模板量極低。（1）特異性強(qiáng)①PCR使用專門合成的DNA引物。②延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。（2）敏感性高這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！4-82（4）簡(jiǎn)便RT-PCR：對(duì)模板的純度要求低。（5）可以擴(kuò)增mRNA先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。（3）快速整個(gè)PCR過(guò)程約2-4小時(shí)即可完成。不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。4-835.PCR技術(shù)的類型（1）常規(guī)PCR（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR（3）錨定PCR（4）反向PCR（5）巢式PCR（6）多重PCR（7）非對(duì)稱PCR（8）免疫PCR（9）定量PCR(熒光實(shí)時(shí)定量PCR)

4-846.PCR技術(shù)的擴(kuò)展在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。準(zhǔn)確地確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。（1）熒光實(shí)時(shí)定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)閾值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4-85（2）反向PCR擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。templatetemplate3’5’5’3’（傳統(tǒng)PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物質(zhì)之間的已知序列）。技術(shù)關(guān)鍵：4-86使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。4-87（3）不對(duì)稱PCR低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA。最后產(chǎn)物中99%是單鏈DNA。3’5’5’3’引物少用于擴(kuò)增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測(cè)序。技術(shù)關(guān)鍵：兩個(gè)引物的濃度相差100倍。4-88（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，1975諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4-89RNAtemplate3’5’下游引物cDNAfirststrand3’5’上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’5’3’5’反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶4-907.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；微量殘留DNA擴(kuò)增；分析模板序列；4-91（2）基因的體外誘變?cè)诨虻哪程幰牒塑账嵬蛔儯ㄈ笔?、重?fù)、插入、替換等）。技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。4-92設(shè)計(jì)引物定點(diǎn)誘變4-93（3）基因組的比較研究利用隨機(jī)引物（一般為8—10bp）通過(guò)PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。比較不同物種之間的基因組特征和相似性。類似于限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)4-94

WalterGilbertFrederickSanger第五節(jié)DNA測(cè)序技術(shù)是對(duì)DNA

分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。4-955.5.1雙脫氧鏈終止法Sanger等1977年發(fā)明。FrederickSanger,1980年NobelPrize化學(xué)獎(jiǎng)4-961.原理（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行的。脫氧核糖的連接是以3’5’磷酸二脂鍵。（2）2’和3’雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終止。（3）通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。4-974-982.技術(shù)要點(diǎn)（1）制備單鏈DNA模板就是待測(cè)序的DNA鏈。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。（2）特殊的DNA聚合酶dNTP/ddNTP=100/1（3）制備2’和3’雙脫氧的ddNTP時(shí),DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200多個(gè)核苷酸序列。4-1004-101基本原理：（1）將一個(gè)DNA片段的5'端磷酸基作放射性標(biāo)記.（2）分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而5‘端被標(biāo)記的DNA片段。（3）這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測(cè)序兩種方法的比較：（1）Maxam-Gilber法所能測(cè)定的長(zhǎng)度要比Sanger法短一些，它對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。（2）Sanger法需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的高質(zhì)量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需簡(jiǎn)單化學(xué)試劑。（3）然而，化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：所測(cè)序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。由于Sanger法既簡(jiǎn)便又快速，因此是現(xiàn)今的最佳選擇方案。事實(shí)上，目前大多數(shù)測(cè)序策略都是為Sanger法而設(shè)計(jì)的。4-107二、DNA序列的自動(dòng)測(cè)定的基本原理和操作方法基本原理由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)家Sanger等人1977年創(chuàng)建的利用DNA聚合酶和雙脫氧核苷酸末端終止法測(cè)序已成為現(xiàn)今自動(dòng)測(cè)序的最佳選擇方案。4-1082.2其獨(dú)特性在于：帶4種不同熒光染料的雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)作為鏈終止劑，而替代了手工測(cè)序的同位素標(biāo)記。采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿基的單鏈DNA。一個(gè)樣品的4個(gè)測(cè)序可以在一個(gè)泳道內(nèi)電泳，從而降低了測(cè)序泳道間遷移率差異對(duì)精確性的影響。電泳之后，就可以通過(guò)全自動(dòng)激光激發(fā)以及熒光檢測(cè)而直接“讀出”堿基順序。

4-109組成包括電泳系統(tǒng)、激光檢測(cè)裝置、電腦、彩色打印機(jī)、DNA序列分析軟件及DNA片段大小和定量分析軟件。該系統(tǒng)采用電腦單點(diǎn)控制整個(gè)DNA測(cè)序儀，包括電泳參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)收集、分析及結(jié)果輸出。電腦可在電泳過(guò)程中對(duì)儀器運(yùn)行狀態(tài)進(jìn)行同步檢測(cè)，電泳結(jié)果可以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。4-1104-1114-112

Whenthedesiredproductisobtained,itwillbesequencedby

theCentralServicesLabSequencing4-1135.6.1基因文庫(kù)（genelibrary)基因文庫(kù)包含基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。是指在一種載體群中，隨機(jī)地收集著某一種生物DNA的各種克隆片段，理想地包含著該物種的全部遺傳信息。第六節(jié)基因文庫(kù)構(gòu)建4-114基因組文庫(kù)（genomiclibrary）：包含某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體稱為基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）：包含細(xì)胞的全部mRNA的信息的重組cDNA克隆群體稱為cDNA庫(kù)。基因組文庫(kù)（含有全部基因）部分基因文庫(kù)：cDNA文庫(kù)(只含有生物體特定發(fā)育階段的全套蛋白質(zhì)編碼序列）1、基因文庫(kù)構(gòu)建的基本程序①DNA的提取及片段化，或cDNA的合成；②載體的選擇及制備；③載體與DNA片段或cDNA連接；④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；⑤轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選；4.6.2基因文庫(kù)的構(gòu)建載體受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀很小，<8kbpUC18/19,T-載體,

pGEM3zλ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀<10kbM13系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbBACE.coli環(huán)狀約300kbYAC酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲(chóng)桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3，PBV，Ti質(zhì)?；蚩寺∷幂d體的特征載體容量越大，所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。4-117

λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本步驟(1)準(zhǔn)備載體DNA。(2)提取高分子量真核細(xì)胞DNA：并選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行部分降解。(3)分離大小合適的真核DNA片段。(4)載體DNA與外源DNA連接。(5)連接產(chǎn)物在體外進(jìn)行包裝。(6)檢測(cè)重組噬菌體的滴度，擴(kuò)增、分裝保存。限制性內(nèi)切酶切割DNA1.特異性切割DNA序列，不完全切割；2.內(nèi)切酶識(shí)別4-8bp核苷酸序列；3.片段大小與限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)出現(xiàn)頻率有關(guān)4-basecutter 44=256bp5-basecutter 45=1,024bp6-basecutter 46=4,096bp8-basecutter 48=65,536bp

分離約~20kb的DNA片段限制性內(nèi)切酶部分消化，

產(chǎn)生的覆蓋片段;分離20kb大小的片段，能包含所有基因組DNA的遺傳信息;要有足夠的克隆數(shù);如:人基因組(3×109bp)~20kb基因片段理論最小值=~150,00099%probabilitythateverysequenceisrepresented=~800,000

部分限制性內(nèi)切酶消化4-120

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kbNNG

GATCCNN

NNCCTAG

GNNinternalfragmentcutwithBamHI(6-basecutter)removeinternalfragment“l(fā)eftarm”“rightarm”cutwithSau3A(4-basecutter)whichhasendscompatiblewithBamHI:

NNNGATCNNN

NNNCTAGNNNisolate~20kbfragmentshumangenomicDNA(isolatedfrom manycells)BamHIsites:combineandtreatwithDNAligase“l(fā)eftarm”“rightarm”“l(fā)eftarm”“rightarm”packageintobacteriophageandinfectE.coli123456

genomiclibraryofhumanDNAfragmentsinwhicheachphagecontainsadifferenthumanDNAsequence74-123EcoRIGenomicLibraryInfectcells4-124

由于mRNA含有某種細(xì)胞的各種RNA分子，因而反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA將代表各樣mRNA拷貝，將其和載體DNA重組，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌里或包裝成噬菌體顆粒，得到一系列克隆群體。每個(gè)克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目克隆的總和則包含細(xì)胞的全部mRNA的信息，這樣的克隆群體叫cDNA文庫(kù)。2cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）4-1252.1按照篩選方式不同cDNA庫(kù)可分為：表達(dá)型cDNA文庫(kù):采用表達(dá)型載體。插入的cDNA片段可表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，不能采用核苷酸探針篩選的目的基因，可采用能與表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合的抗體或化合物進(jìn)行標(biāo)記篩選。非表達(dá)型cDNA文庫(kù)：適用于那些采用核苷酸探針進(jìn)行雜交篩選的基因。4-126根據(jù)載體的不同將cDNA庫(kù)分為：質(zhì)粒cDNA庫(kù):包含的cDNA克隆數(shù)目較少，適于較高豐度的mRNA噬菌體cDNA庫(kù):包含的cDNA克隆數(shù)目非常多，適用于那些低豐度和極低豐度的mRNA4-127mRNA提取

cDNA合成

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體

受體菌

復(fù)制1）cDNA只含有對(duì)應(yīng)于成熟mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2）cDNA一般較短，平均長(zhǎng)度1.5kb左右，多數(shù)為100bp至10kb。3）表達(dá)譜的時(shí)空動(dòng)態(tài)性決定了cDNA文庫(kù)的多樣性。4）不同基因的cDNA間存在豐度上的差異。*cDNA文庫(kù)的構(gòu)建4-128mRNA提取

cDNA合成

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體

受體菌

復(fù)制1）cDNA只含有對(duì)應(yīng)于成熟mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2）cDNA一般較短，平均長(zhǎng)度1.5kb左右，多數(shù)為100bp至10kb。3）表達(dá)譜的時(shí)空動(dòng)態(tài)性決定了cDNA文庫(kù)的多樣性。4）不同基因的cDNA間存在豐度上的差異。*cDNA文庫(kù)的構(gòu)建4-129mRNA提取

cDNA合成

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體

受體菌

復(fù)制1）cDNA只含有對(duì)應(yīng)于成熟mRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。2）cDNA一般較短，平均長(zhǎng)度1.5kb左右，多數(shù)為100bp至10kb。3）表達(dá)譜的時(shí)空動(dòng)態(tài)性決定了cDNA文庫(kù)的多樣性。4）不同基因的cDNA間存在豐度上的差異。*cDNA文庫(kù)的構(gòu)建①總RNA的提取RNAmRNArRNAtRNA②mRNA分離純化（親和層析）4-133AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcDNAsynthesisInfectcellscDNAlibrary4-1342.2篩選cDNA庫(kù)方法①核酸探針原位雜交篩選法；②免疫球蛋白結(jié)合篩選法；③用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4-1354-136凝膠阻滯電泳DNaseI足跡法第七節(jié)DNA與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay）又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay）是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。

凝膠阻滯電泳4-138凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合4-139(a)(b)

(c)

在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA之間的競(jìng)爭(zhēng)作用（a）沒(méi)有加入競(jìng)爭(zhēng)DNA的正常的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（c）競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。**********蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影蛋白質(zhì)與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合**********用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過(guò)足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之