有機(jī)磷酸酯類中毒及解救

有機(jī)磷酸酯類中毒及解救ToxicationandDetoxicationofOrganophosphates【目的和原理】觀察有機(jī)磷酸酯類(organophosphates)中毒的癥狀，理解解救藥阿托品、解磷定的解救作用及機(jī)制。掌握家兔耳緣靜脈注射的方法。Organophosphates通過抑制膽堿酯酶(cholinesterase,AChE)活性，使乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)在體內(nèi)堆積，產(chǎn)生中毒癥狀?？鼓憠A藥阿托品能解除有機(jī)磷酸酯類中毒的M樣癥狀，而解磷定可復(fù)活A(yù)ChE，恢復(fù)其水解ACh的能力，對(duì)M及N樣癥狀均有效，以緩解骨骼肌震顫的效果最快，兩藥合用可提高解救效果。【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物】家兔，體重2.5?3.0kg?！緦?shí)驗(yàn)器材和藥品】兔固定箱、測(cè)瞳尺、聽診器、注射器(5ml、10ml、20ml)、針頭、兔耳夾、脫脂棉球、臺(tái)秤、722分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、試管及試管架、加樣器、effendorff管、濾紙。10%美曲膦酯［敵百蟲(depterex)］、0.05%硫酸阿托品(atropinesulfate)、2.5%解磷定(pyridinealdoximemethiodide,PAM)、生理鹽水(saline)?！緦?shí)驗(yàn)步驟和觀察項(xiàng)目】1．健康家兔5只，稱體重，分為5組，分別為空白對(duì)照組(甲)、模型組(乙)、給解救藥組：atropine組(丙)、PAM組(丁)、atropine+PAM組(戊)，觀察并記錄各組家兔的活動(dòng)情況：呼吸(頻率、幅度、肺呼吸音、有無呼吸困難，呼吸道有無分泌物等)，瞳孔大小(pupillarysize)，唾液分泌(salivarysecretion),大小便(urinationanddefecation),肌張力(musculartension)及有無肌肉震顫(muscletremor)等。2．將甲、乙、丙、丁、戊、五只家兔分別放于兔固定箱內(nèi)，甲兔由耳緣靜脈給予salin(e1ml/kg)；乙、丙、丁、戊兔分別由耳緣靜脈緩慢注入depterex(1ml/kg)，給藥后密切觀察上述指標(biāo)的變化并記錄。待M樣、N樣中毒癥狀均較明顯時(shí)，乙兔不予解救藥，使其中毒癥狀充分表現(xiàn)出來，如果死亡，分析死亡原因；丙兔耳緣靜脈注射atropine(2ml/kg)，丁兔耳緣靜脈緩慢注射PAM(4ml/kg),戊兔耳緣靜脈先atropine(2ml/kg)，而后注射PAM(4ml/kg),觀察中毒癥狀有何變化，atropine和PAM分別改善了哪些癥狀？3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄:一般呼吸心率瞳孔唾液大小便肌張力肌震顫狀態(tài)次/min次/min大小分泌給藥前給敵百蟲給阿托品給解磷定阿+解附：膽堿酯酶活性測(cè)定(determinationofactivityofAChE)【目的和原理】學(xué)習(xí)AChE活性的測(cè)定方法,觀察中毒前后及使用不同解救藥后AChE活性的變化。ACh在血液中被AChE水解，產(chǎn)生醋酸和膽堿。在一定范圍，水解的ACh量與AChE的活性成正比。故在反應(yīng)體系中，加入定量的ACh使之參加反應(yīng)，通過測(cè)定剩余的ACh即可計(jì)算出水解ACh的量，從而推算出AChE活性。ACh的呈色反應(yīng)ACh可與羥胺反應(yīng)生成乙酰羥肟酸，后者在酸性條件下與三價(jià)鐵離子形成褐色的羥肟酸鐵絡(luò)合物，其顏色的深淺可反映ACh含量。反應(yīng)過程如下：鹽酸羥胺與氫氧化鈉作用釋放出游離羥胺NH20H?HCL+NaOH—NH20H+NaCL+H20剩余ACh與游離羥胺作用，生成羥肟酸化合物(CH3)三N—(CH2)2OCOCH3+NH2OH—CH3CONHOH+(CH3)3三N—(CH2)20H羥肟酸化合物在酸性環(huán)境中與三氯化鐵生成褐色復(fù)合物(羥肟酸鐵絡(luò)合物)酸性Fe/3FeCL3+CH3CONHOHCH3CONHO+HCL(棕紅色)【實(shí)驗(yàn)藥品】7X10-3mol/L氯化ACh：取ACh用蒸餾水配成2.54%溶液，冰箱保存。用前以蒸餾水20倍稀釋即成7X10-3mol/LACh溶液。lmol/L鹽酸羥胺(NH2OH?HCL)：取25g鹽酸羥胺，加蒸餾水359ml，冰箱保存。3.5NNaOH。4NHCL。3.7X10-lmol/L三氯化鐵(FeCL3?6H2O)：取10g三氯化鐵，加蒸餾水至20ml,濃HCl0.84ml，加溫溶解，最后加蒸餾水至100ml制成3.7X10-lmol/L三氯化鐵(FeCL30.1NHCl)溶液。PH7.2的磷酸緩沖液：取Na2HPO4?12H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸餾水至100ml,冰箱保存。【實(shí)驗(yàn)步驟】家兔在給藥前、中毒癥狀明顯后、給atropine待癥狀明顯緩解后、給予PAM解救后Omin、10min、20min、30min等時(shí)間點(diǎn)分別由兔耳緣靜脈或股靜脈取血0.5ml,測(cè)定AChE活性。具體步驟見表1。取20ml試管若干個(gè)，按表加入磷酸緩沖液0.85~lml,血樣0~0.15ml,置37°C±1°C恒溫水浴中預(yù)熱3~5min。加入7X10-3mol/LACh溶液1.0ml(用加樣器)，于37C±1C水浴中反應(yīng)40min，每隔lOmin搖動(dòng)一次。反應(yīng)40min后立即加入堿性羥胺(lmol/LNH20H?HCL與3.5NNaOH溶液在用前20min等容混合，并不斷震蕩)4.0ml。依次加入4NHCL和3.7X10-1mol/LFeCL3各2ml，每加入一種試劑都要充分振蕩。上述反應(yīng)液均用濾紙過濾，將濾液倒入比色杯中，以530nm的波長(zhǎng)比色。對(duì)照管(標(biāo)準(zhǔn)ACh值)：為反應(yīng)體系中全量ACh對(duì)照。空白管：為無血、無Ach的其它試劑對(duì)照。對(duì)照管與空白管操作步驟同其它樣品(見表)。以上操作順序見表?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】計(jì)算酶活性：全血AChE活性值以0.15ml全血在40min內(nèi)水解ACh的pmol數(shù)表示(pmol/0.15ml/40min)酶活性計(jì)算：OD標(biāo)準(zhǔn)管一OD測(cè)定管全血AChE活性值=X7OD標(biāo)準(zhǔn)管酶活性值百分?jǐn)?shù)計(jì)算樣本AChE活性值X100%正常全血AChE活性值1．繪制時(shí)效曲線根據(jù)給予PAM解救后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AChE活性值制圖。酶活性(％)時(shí)間【注意事項(xiàng)】Depterex屬于劇毒殺蟲劑，且可從皮膚吸收，如與手等接觸后，應(yīng)立即用清水清洗。給家兔depterex后，15min仍未出現(xiàn)中毒癥狀，可再追加1/3劑量的depterex溶液。3?測(cè)定AChE活性時(shí)，加入每種試劑時(shí)劑量一定要準(zhǔn)確。思考題】1.有機(jī)磷酸酯類藥物中毒有哪些表現(xiàn)？藥物效應(yīng)是否有個(gè)體差異？Atropine和PAM可解除有機(jī)磷中毒的哪些癥狀和體征？有何不同？為什么？使用atropine和PAM解救后，家兔全血AChE活性有何變化？表AChE活性的測(cè)定步驟磷全水ACh蒸水堿性鹽三氧化過ODAchE酸血浴餾浴羥胺酸鐵濾活性緩水（%）沖液空白管1.04.02.02.0標(biāo)準(zhǔn)管1.01.04.02.02.0乙兔給藥前0.850.151.04.02.02.0中毒時(shí)0.850.151.04.02.02.0丙兔31.01.0ml40min4.02.02.0給藥前0.850.15中毒時(shí)0.850.151.04.02.02.0阿托品后0.850.151.04.02.02.0戊兔給藥前0.850.1551.04.02.02.0中毒時(shí)0.850.15min1.04.02.02.0阿托品后0.850.151.04.02.02.0PAM后00