腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定2007.9-試驗(yàn)?zāi)康募耙饬x：

分離并培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，建立以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為主的體外血腦屏障，以進(jìn)一步研究導(dǎo)致腦部感染性疾病的病原微生物穿透或破壞血腦屏障的致病機(jī)制。試驗(yàn)注意事項(xiàng)

全程嚴(yán)格無(wú)菌操作，操作時(shí)室內(nèi)空調(diào)16°c，消化之前的全部步驟均在冰上進(jìn)行。操作時(shí)間以2－3小時(shí)內(nèi)為宜。實(shí)驗(yàn)試劑：

DMEM、30％葡聚糖Dextran、10×PBS及PBS（無(wú)鈣、鎂離子）、RPMI1640、肝素heparin、丙酮酸鈉、Ι型膠原蛋白CollagenType1、MEMnon-essentialaminoacids、膠原蛋白酶Collagenase/Dispase（以上各試劑4℃保存）、FBS(胎牛血清)、1：1萬(wàn)單位青、鏈霉素雙抗、NuSerum、ECGS、L-谷氨酰胺、MEMvitamins、DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)、胰酶（以上各試劑－20℃保存）。試驗(yàn)器材：

冰盤(pán)、圓口瓶、血清瓶、青霉素瓶、燒杯（各種大?。?、平皿（各種大?。?、眼科剪、眼科鑷、勻漿器、15ml和50ml離心管、吸管、滴管、培養(yǎng)瓶、注射器、0.22μm針頭濾器、漏網(wǎng)、漏勺、200μl及1ml槍頭、大量冰塊（沙）或者冰袋。器材準(zhǔn)備所有金屬、搪瓷器皿必須用洗衣粉水仔細(xì)清洗，流水沖洗、烘干后酒精浸泡消毒，之后自然風(fēng)干，包裝高壓。所有玻璃器皿需清洗泡酸、包裝后高壓。培養(yǎng)瓶的處理：購(gòu)買(mǎi)一次性培養(yǎng)瓶，大小為25c㎡。以5－10μg/c㎡為包被濃度，于瓶中加入Ι型膠原蛋白平置搖勻浸沒(méi)培養(yǎng)面并放于4℃過(guò)夜，次日將液體吸出（可重復(fù)利用），置于紫外燈下照1h。4℃?zhèn)溆?。塑料漏網(wǎng)、血清瓶蓋、橡膠瓶蓋洗凈后均用蒸餾水煮開(kāi)，并包裝高壓。器材準(zhǔn)備玻璃小球高壓前用蒸餾水沖洗玻璃小球柱：將一個(gè)10ml的注射器，切去頭部，用篩網(wǎng)蒙住切口端，將篩網(wǎng)綁緊，然后以篩網(wǎng)為底，往注射筒中倒入玻璃小球，使之高度大約為1ml，然后高壓。在使用之前用1640將玻璃小球濕潤(rùn)，或者，用0.4的過(guò)濾紙搭配50ml的試管亦可。離心機(jī)用洗衣粉水清洗，蒸餾水沖洗，并且酒精擦洗消毒。試劑配制雙抗：用三蒸水將青霉素、鏈霉素配成雙抗1:10000U，然后過(guò)濾分裝，－20℃保存。100×L-谷氨酰胺：稱(chēng)量2.923gL-谷氨酰胺，定容于100mlddH2O，濃度為200mmol/L。0.22針頭濾器過(guò)慮。－20℃保存。肝素：用PBS將粉劑肝素溶解為500U/ml，過(guò)濾后4℃保存組織洗滌液：2％FBS，10％雙抗（如為無(wú)菌手術(shù)標(biāo)本則為2％），DMEM。4℃保存。FBS需先56℃滅活過(guò)濾、分裝。－20℃保存。試劑配制5.100ml10×PBS(其中不能含有鈣以及鎂離子)：80ml蒸餾水中溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4加水定容到100mL，取20ml10×PBS，加入180ml去離子水，配成200mlPBS，高壓滅菌，室溫或4°c保存。6.200ml30％葡聚糖：60g溶于200ml去離子水中，高壓滅菌(15磅15分鐘，放氣后立即取出，防止碳化)。

取200ml葡聚糖，與22ml10×PBS混合。（9:1）4°c保存。試劑配制5.消化液：用蒸餾水將膠原蛋白酶和Dnasel分別溶解成100mg/ml。4°c保存。試驗(yàn)進(jìn)行至消化環(huán)節(jié)時(shí)用DMEM將Dnasel和膠原蛋白酶配成終濃度分別為為0.1mg/mlDNasel，1mg/ml膠原蛋白酶的液體。各種組成混合后0.22過(guò)濾滅菌(100mg/ml的DNasel2ul,膠原蛋白酶20ul加入到2mlDMEM中混勻，0.22um過(guò)濾，加入15ml離心管中）。6.培養(yǎng)基（以下各濃度均為終濃度）：RMPI1640，10％FBS，10％NuSerum，ECGS30μg/ml，1％雙抗，肝素5U/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，1mmol/L丙酮酸鈉，MEMnon-essentialaminoacids，MEMvitamins各1％。各組分過(guò)濾后混合。4°c保存。

試驗(yàn)步驟1.

取腦：將手術(shù)取下的新鮮腦組織置于組織漂洗液中，回實(shí)驗(yàn)室后再反復(fù)漂洗幾次去除血凝塊。（8只2-3周的大鼠。）2.取出組織塊放于含有小培養(yǎng)皿上（含有少量培養(yǎng)液），培養(yǎng)皿置于冰上。（以后各步驟均于冰上進(jìn)行）3.用鑷子小心剝離組織上的軟腦膜及肉眼可見(jiàn)的小血管，待剝離干凈后再小心取出灰質(zhì)部分即腦皮質(zhì)，置于放有漏網(wǎng)的漏勺上。試驗(yàn)步驟Collectiontube4.用研磨棒將組織輕輕研磨，使其從漏網(wǎng)中漏過(guò)，分散入平皿中（約含有10ml組織洗滌液）。試驗(yàn)步驟5.將平皿里的液體轉(zhuǎn)移入勻漿器中，上下推動(dòng)10次左右，直到?jīng)]有肉眼可見(jiàn)的大組織塊。液體呈現(xiàn)出“奶昔”狀。液體轉(zhuǎn)移入50ml離心管中。試驗(yàn)步驟6.在裝有組織懸液的離心管中，加入與懸液等體積的葡聚糖－PBS混合物。（可見(jiàn)分層）4℃8000rpm離心15min。試驗(yàn)步驟7.吸出上層液體及白色脂質(zhì)，以1－2mlPBS小心沖散紅色目標(biāo)沉淀物（即含有微血管的組織），盡量將目標(biāo)物沖洗盡，然后將PBS－組織懸液吸入干凈的離心管。試驗(yàn)步驟試驗(yàn)步驟8.取40-45mlPBS加入離心管中，3000rpm,4°c離心5min。重復(fù)2次。其目的是將葡聚糖洗脫。問(wèn)題：上清液中?？梢?jiàn)懸浮小塊，經(jīng)離心后證實(shí)其中含有目標(biāo)組織解決方法：或減少每次PBS用量、3次離心；或加大轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間；或上清再次離心。PurifiedMicrovessels9.倒出（或吸出）PBS，吸取1－2ml組織洗滌液將目標(biāo)沉淀物沖散、吸出，轉(zhuǎn)移至干凈的15ml離心管中。

然后取一平皿或燒杯，用組織洗滌液稀釋Dnasel和膠原蛋白酶，使之加入離心管后終濃度分別為0.1mg/ml和1mg/ml。以注射器吸出，用0.22針頭濾器過(guò)濾至準(zhǔn)備好的離心管中。試驗(yàn)步驟10.混勻后放入37℃搖床中消化，30分鐘左右取出一滴至鏡下觀(guān)察，如見(jiàn)到大量細(xì)短串狀的微血管（3、4個(gè)細(xì)胞一串），則表示消化適度，3000－4000rpm5分鐘離心；如為大團(tuán)狀或已成單個(gè)細(xì)胞，則消化不足或消化過(guò)度。試驗(yàn)步驟beforeafter試驗(yàn)步驟11.離心后棄上清，以PBS3000－4000rpm5分鐘離心，得到的沉淀以2－3ml細(xì)胞培養(yǎng)液沖散、混勻，放入37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)，5個(gè)小時(shí)左右后再加入1－2ml培養(yǎng)液。此為原代細(xì)胞P1（[=parentalgeneration]親代）

之后每日觀(guān)察細(xì)胞狀況，貼壁前2－3日半換液，全部細(xì)胞貼壁后視培養(yǎng)液情況每1－2日全換液一次。細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底80％左右即可考慮傳代及凍存。試驗(yàn)記錄2007年