現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)之DNA克隆

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)

二十一世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要特點(diǎn)之一是對(duì)生命現(xiàn)象和疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)深入到分子水平。健康的保持或疾病的發(fā)生都與生物分子相互作用密不可分，這一理念已成為共識(shí)。分子生物學(xué)已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的主流,分子生物學(xué)技術(shù)是相關(guān)研究必不可少的工具。

多年來(lái),已建立了許多分子生物學(xué)技術(shù)，新的技術(shù)還在不斷出現(xiàn),從不同水平探索生命的奧秘。核酸分析相關(guān)技術(shù)是其重要基礎(chǔ)。本章將以此為起點(diǎn)與核心，介紹分子生物學(xué)的常用技術(shù)及新進(jìn)展。第一節(jié)、DNA克隆第二節(jié)、DNA、RNA的分析及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)第三節(jié)、蛋白質(zhì)的表達(dá)及蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要技術(shù)第四節(jié)、表觀遺傳學(xué)分析技術(shù)簡(jiǎn)介第五節(jié)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因打靶技術(shù)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)載體的概念、特征和類(lèi)型；重組DNA技術(shù)、PCR技術(shù)的原理、步驟和應(yīng)用；實(shí)時(shí)定量PCR的概念。Southern和Northern雜交的原理、步驟和應(yīng)用；DHPLC檢測(cè)DNA變異的基本原理；染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理及應(yīng)用；報(bào)告基因的概念。蛋白質(zhì)表達(dá)主要檢測(cè)方法的類(lèi)別；蛋白質(zhì)組學(xué)的概念。RNA干擾、miRNA的概念、作用機(jī)制、研究策略及應(yīng)用；亞硫酸氫鹽處理DNA后，進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)的基本原理。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及基因打靶的概念，影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的因素。本章重點(diǎn)內(nèi)容提示第一節(jié)、DNA克隆克隆的概念克隆(clone)：是指用無(wú)性繁殖的方法產(chǎn)生與親代完全相同的子代個(gè)體或群體。分子克隆（DNA克?。?細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）精細(xì)胞卵細(xì)胞有性繁殖（母源和父源基因組）

乳腺細(xì)胞卵細(xì)胞子宮內(nèi)胚胎發(fā)育無(wú)性繁殖（核供體基因組）DNA克隆是特異DNA片段或基因的選擇擴(kuò)增細(xì)胞—DNA克隆：利用細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制機(jī)制PCR—DNA克?。杭?xì)胞外或體外多聚酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)一、細(xì)胞—DNA克隆

實(shí)現(xiàn)DNA克隆所采用的方法稱(chēng)為重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）:

人類(lèi)根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體連接形成重組DNA分子,然后導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞,使其擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段;或表達(dá)相應(yīng)的基因產(chǎn)物。重組DNA技術(shù)，興起于20世紀(jì)70年代。基因工程是重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用。人類(lèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因進(jìn)行自如地操作、轉(zhuǎn)移和改造的理想，是在限制性核酸內(nèi)切酶、載體、連接酶和其它修飾酶被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)以后才得以實(shí)現(xiàn).1限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）

70年代早期，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中存在能切割雙鏈DNA的酶，限制進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的外源DNA，稱(chēng)為限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）。迄今已從不同細(xì)菌中分離了許多種限制酶，其發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用促進(jìn)了重組DNA技術(shù)的發(fā)展。1）限制酶分類(lèi)

幾乎所有原核生物都含有限制酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Ⅰ型切點(diǎn)不固定Ⅲ型切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外Ⅱ型特異性切點(diǎn)位置可以控制和預(yù)測(cè)，產(chǎn)生固定的DNA片段，重組DNA技術(shù)中所用的限制酶均為Ⅱ型。

2）限制酶命名命名原則：根據(jù)限制酶來(lái)源的微生物學(xué)名命名。第1個(gè)字母大寫(xiě)（斜體）代表該酶宿主菌的屬名第2、3個(gè)字母小寫(xiě)（斜體）代表該酶宿主菌的種名第4個(gè)字母大寫(xiě)（正體）代表該酶宿主菌的菌株。如果從一個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了數(shù)種限制酶，根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。從EscherichiacoliRY13中第1個(gè)分離的限制性酶

EcoRⅠ3）限制酶識(shí)別序列限制酶切斷DNA分子磷酸二酯鍵的核酸酶。

酶

來(lái)源

切割序列長(zhǎng)度kb(人類(lèi)DNA)HaeIIIHemophilusaegyptusGGCC0.6TaqIThermusaquaticusTCGA1.4HindIIIHemophilus

influenzaeRdAAGCTT3.1EcoRIEscherichiacoliRfactorGAATTC3.1PstIProvidenciastuartiiCTGCAG7.0SmaISerratiamarcescensCCCGGG78NotINorcadiaotitida-caviarumGCGGCCGC97664）限制酶主要特征（1）特異識(shí)別4~8個(gè)堿基對(duì)，通常為回文序列，即按5′→3′方向閱讀，

DNA雙鏈堿基順序相同。（2）

切斷DNA分子的磷酸二酯鍵（3）限制片斷末端：平末端（bluntends）：切割點(diǎn)在識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)軸上突出末端（overhangingends）：交錯(cuò)切割DNA5′突出末端

3′突出末端突出末端易于通過(guò)堿基互補(bǔ)彼此連接，又稱(chēng)黏性末端產(chǎn)生相同突出末端的DNA片段，可有三種方式：①用相同的限制酶②用識(shí)別序列相同的不同限制酶即同裂酶(isoschizomers)；③用識(shí)別不同序列但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶；如BamHI和MboI。不同限制酶切割產(chǎn)生的限制性片段

2、

DNA連接酶1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)一種封閉DNA鏈上缺口的酶，借助ATP等水解提供的能量催化DNA鏈的5′-PO4-與另一DNA鏈的3′-OH生成磷酸二酯鍵，即DNA連接酶。經(jīng)限制酶切割和DNA連接酶的作用，將靶DNA序列和載體DNA連接成重組DNA3.載體

1）載體的定義及其特征（1）載體(vector)定義：將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。

①分子量小，以容納較大的外源DNA；②有多種限制酶單一識(shí)別序列，有助于外源

DNA片段插入；

③載體DNA被切割并插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力

④有標(biāo)記基因，有利于篩選重組體。

⑤克隆載體上要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體上還要有啟動(dòng)子。（2）載體特征根據(jù)載體用途分為：克隆載體：攜帶的外源DNA片段在宿主細(xì)胞中增殖、擴(kuò)大數(shù)量。克隆載體上需有復(fù)制起始點(diǎn).表達(dá)載體：攜帶的外源DNA片段或基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生RNA和/或蛋白質(zhì)。表達(dá)載體上還需有啟動(dòng)子。常用的載體：

質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒

PI、BAC、YAC

2）載體分類(lèi)(1)質(zhì)粒（plasmid）細(xì)菌中獨(dú)立于染色體外的雙鏈閉環(huán)DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。天然質(zhì)粒需經(jīng)改造才能適用于DNA克隆*插入多克隆位點(diǎn)：人工合成

30bp左右的一段DNA序列，含有多種限制酶的單一切點(diǎn)*插入抗生素抗性基因：如Ampr*建立用于重組子篩選的選擇系統(tǒng)，將多克隆位點(diǎn)置于可表達(dá)的標(biāo)志基因中間。

能夠攜載外源DNA分子＜

10kb

質(zhì)粒(plasmid)(2)λ噬菌體（lambdaphage）高效感染細(xì)菌的病毒DNA分子為線性雙鏈5′末端是12個(gè)核苷酸突出的粘性末端，即cos序列。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，COS序列堿基配對(duì)環(huán)化。①置換λ載體:外源DNA片段取代λ噬菌體DNA分子中間部分的基因。

插入片段：9-23kb

常用于制備基因組DNA文庫(kù)②插入λ載體:外源DNA片段插入λ基因組的CI基因.

插入片段：〈10kb

常用于制備cDNA文庫(kù)(3)粘粒（cosmid）將質(zhì)粒和λ噬菌體改建的載體，改造后含λ噬菌體的COS序列以及質(zhì)粒（plasmid）特性:攜帶外源DNA分子約30-45kb。(4)P1噬菌體和

P1衍生人工染色體（PAC）P1噬菌體:其DNA為線性，體外包裝于蛋白質(zhì)殼內(nèi)。P1DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。攜帶外源DNA片段約100kb將P1噬菌體和F因子結(jié)合構(gòu)成了PAC，攜帶外源DNA片段約130-150kb

。(5)細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

是基于大腸桿菌的F因子構(gòu)建的、低拷貝的質(zhì)粒載體。（F因子是大腸桿菌中自然存在的一種致育質(zhì)粒，編碼多種參與復(fù)制、分配和接合過(guò)程的蛋白質(zhì)）

BAC分子中攜帶：抗生素抗性標(biāo)記、復(fù)制子oriS、利于DNA復(fù)制的解旋酶（RepE）以及確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA,parB等

）

它不同于一般質(zhì)粒，能攜帶外源DNA片段>300kb35YAC的結(jié)構(gòu)特征

1）著絲粒：有絲分裂姊妹染色單體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶侵襲。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：染色體自主復(fù)制的起點(diǎn)。與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。攜帶外源DNA片段：0.2-2Mb(6)酵母人工染色體（YAC）

（yeastartificialchromosome,YAC）362個(gè)端粒1個(gè)著絲粒1個(gè)自主復(fù)制元件（ARS）4細(xì)胞—DNA克隆

主要步驟主要有以下步驟

1）分離純化目的基因

2）構(gòu)建重組DNA分子

3）宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

4）含重組體的宿主細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增

5）分離重組DNA第一步驟

分離純化目的基因1.

化學(xué)合成目的基因

2.從基因組DNA文庫(kù)中獲取

3.從cDNA文庫(kù)中獲取

4.用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）合成

第二步驟：構(gòu)建重組DNA分子選擇適當(dāng)?shù)妮d體；將目的DNA和載體DNA分別經(jīng)某種限制性?xún)?nèi)切酶消化后，將二者置于一個(gè)反應(yīng)體系，相同粘性末端借氫鍵互補(bǔ)連接（粘性末端一般為4個(gè)核苷酸，氫鍵比較弱，只能在低溫維持）。連接酶（ligase）使兩個(gè)分子以共價(jià)鍵連接（形成磷酸二酯鍵），構(gòu)成重組DNA分子。

第三步驟：宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（transformation）目的DNA片段與載體連接構(gòu)成的重組體，導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)菌（competentcell）

細(xì)菌細(xì)胞膜具有選擇通透性，不允許大分子通過(guò)。當(dāng)細(xì)菌先暴露于高離子強(qiáng)度溶液(CaCl2)或經(jīng)短暫電休克等作用后，其通透性增高，部分細(xì)菌能從環(huán)境中攝入外源DNA，稱(chēng)感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化第四步驟：含重組體的宿主細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增

將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面：培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素；

載體分子中含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，只有導(dǎo)入載體的細(xì)菌才能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；

導(dǎo)入的載體是自身環(huán)化還是含有目的片斷的重組載體，有待進(jìn)一步篩選。篩選有多種方法，藍(lán)白篩選是其中常用的一種。載體中還含有標(biāo)志基因-β-半乳糖苷酶基因片段，其產(chǎn)物與缺陷株細(xì)菌產(chǎn)生的另一部分半乳糖苷酶產(chǎn)生α互補(bǔ)，使培養(yǎng)基中無(wú)色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)。

多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites,MCS）設(shè)計(jì)在標(biāo)志基因內(nèi)，MCS本身不影響標(biāo)志基因表達(dá)。外源DNA片段插入MCS后，標(biāo)志基因表達(dá)喪失—插入失活?？蓞^(qū)分僅含載體的宿主菌（菌落為藍(lán)色）和含重組DNA的菌落（菌落為無(wú)色）挑取含重組DNA的菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。得到大量含重組DNA的細(xì)菌第五步驟：分離重組DNA收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子并純化。由于一個(gè)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞最初常常僅攝取一個(gè)重組DNA分子，純化的重組DNA分子完全一致，稱(chēng)DNA克隆。通過(guò)酶切方法獲得目的DNA片段，測(cè)序鑒定。DNA克隆53DNA文庫(kù)（DNAlibrary)：指通過(guò)DNA克隆(重組)技術(shù)人工構(gòu)建的包含某一特定來(lái)源DNA所有片段的重組DNA克隆總和。DNA來(lái)源不同：可構(gòu)建不同的DNA文庫(kù)1.基因組DNA文庫(kù)2.cDNA文庫(kù)5DNA文庫(kù)（DNAlibrary）

1）基因組DNA文庫(kù)（genomicDNAlibrary）應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的含有基因組全部DNA序列的DNA克隆總和。DNA來(lái)源：人類(lèi)幾乎所有細(xì)胞的核基因組DNA相同，可用易得到的外周血細(xì)胞DNA制備基因組DNA文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)具有種屬特異性，但無(wú)組織特異性

2）cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）不同組織及不同發(fā)育階段的細(xì)胞基因表達(dá)不同。以來(lái)源于特定（類(lèi)型或發(fā)育階段）組織的mRNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；與含有某一種限制酶切點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸接頭連接后，用該酶切割成粘性末端，與載體連接后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,由此得到的所有陽(yáng)性菌落總和,稱(chēng)該組織的cDNA文庫(kù).cDNA文庫(kù)既有種屬特異性，也有組織特異性?？蓮哪骋惶囟ńM織的cDNA文庫(kù)中分離該組織表達(dá)的基因.

cDNA文庫(kù)構(gòu)建DNA文庫(kù)意義文庫(kù)建立后，可從中篩查分離所需的目的基因或cDNA核酸雜交：將菌落原位印跡在硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的特異性DNA探針同膜雜交，放射自顯影后可以確定插入特異DNA片段的克隆菌。

cDNA文庫(kù)通過(guò)特異性抗體或配體篩查表達(dá)性cDNA

文庫(kù)，可得到含有相應(yīng)cDNA的克隆菌6目的基因表達(dá)

將目的基因與表達(dá)載體重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達(dá)出相應(yīng)基因產(chǎn)物RNA或蛋白(如胰島素,干擾素,特異基因的抗原等）-----目的基因表達(dá)

表達(dá)載體的主要組成成分：

多克隆位點(diǎn)強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子復(fù)制起點(diǎn)

核糖體結(jié)合位點(diǎn)下游有轉(zhuǎn)錄終止序列重組表達(dá)載體（1）在細(xì)菌中表達(dá)真核細(xì)胞基因的基本要求①由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，真核細(xì)胞基因不能直接在細(xì)菌中表達(dá)。

將編碼特定多肽的目的cDNA插入表達(dá)載體1）原核表達(dá)體系②表達(dá)系統(tǒng)常需構(gòu)建可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子大量外源蛋白或多肽對(duì)宿主細(xì)胞本身有害。開(kāi)始時(shí)大量培養(yǎng)含有重組DNA的宿主菌，無(wú)外源基因表達(dá)。而后將誘導(dǎo)物加入細(xì)菌培養(yǎng)物，啟動(dòng)插入基因表達(dá)，使細(xì)菌短時(shí)間內(nèi)表達(dá)多肽或蛋白產(chǎn)物，收獲細(xì)菌并提取表達(dá)產(chǎn)物。

產(chǎn)物特征：細(xì)菌內(nèi)缺乏翻譯后加工機(jī)制，多肽常不穩(wěn)定，產(chǎn)物活性有限或無(wú)活性。

2).真核表達(dá)體系

如酵母、昆蟲(chóng)及哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物較穩(wěn)定且具有功能活性

缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì)

二、PCR-DNA克隆聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）PCR：模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，體外程序化的特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)

1.PCR的基本原理 1）PCR反應(yīng)中的主要成份特異性引物、dNTP、模板DNA、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶及含有Mg2＋的緩沖液。

（1）引物：PCR首先需要合成一對(duì)與目的DNA序列兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物（primer）一般長(zhǎng)度為18-25bp引物的作用是限定擴(kuò)增目的DNA，達(dá)到選擇性和特異性DNA克隆的目的。

PCR的基本原理（2）PCR必需有DNA合成的原料（dNTP），

dATP

dCTP即4種脫氧三磷酸核苷：

dGTP

dTTP

PCR的基本原理（3

）模板DNA：其數(shù)量和純度影響PCR產(chǎn)物.

一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102-105個(gè)拷貝,模板量過(guò)多則可能增加非特異性產(chǎn)物.DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。

PCR的基本原理（4）熱穩(wěn)定的DNA聚合酶：常用TaqDNA聚合酶。

（5）含有Mg2＋反應(yīng)緩沖液：影響DNA聚合酶的活性

PCR的基本原理2）PCR的基本反應(yīng)步驟： （1）變性：93℃-95℃，模板DNA完全變性成為單鏈； （2）復(fù)性：50℃-70℃，引物與模板DNA退火結(jié)合；（3）延伸：70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。 上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán).

PCR的基本原理PCR是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：每個(gè)周期合成的新鏈可作為下一周期合成DNA的模板，循環(huán)擴(kuò)增DNA。反復(fù)n個(gè)周期，可擴(kuò)增2n倍DNA。經(jīng)25～30次循環(huán)后，可獲得百萬(wàn)倍以上的目的DNA。

PCR擴(kuò)增的DNA量足以直接通過(guò)溴化乙淀染色后紫外燈下觀察。

PCR擴(kuò)增NGF基因（大鼠）ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacgga

gactccgttc541

accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc

-3’Perim1:(5’)gatcggcgtacaggcagaac(3’)328-347Perim2:(3’)cgcggggtgaacggagtctc(5’)529-548

預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度：220bpPCR過(guò)程

DNAMarkerNGF←200bp←100bp220bp→2PCR的特點(diǎn)快速：PCR一個(gè)周期僅為3-5分鐘，經(jīng)過(guò)30個(gè)周期約幾個(gè)小時(shí)，可得到足量的目的DNA用于分析靈敏：PCR能夠擴(kuò)增少量目的DNA，甚至單個(gè)細(xì)胞DNA，有助于極少量標(biāo)本的研究；如法醫(yī)學(xué)物證、分子病理學(xué)、產(chǎn)前基因診斷等。適用樣品廣泛

：有時(shí)標(biāo)本是混雜物，難以分離DNA或DNA部分降解，如化石標(biāo)本、福爾馬林固定的標(biāo)本等。3PCR局限性產(chǎn)物片段短?。阂话阈∮?kb②一定的錯(cuò)配率:

高保真Taq酶可大大降低錯(cuò)配率；它適合對(duì)PCR保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、測(cè)序、突變檢測(cè)等

③產(chǎn)量有限：?jiǎn)我籔CR反應(yīng)中克隆的DNA量有限，且有時(shí)不適合某些后續(xù)研究?？衫眉?xì)胞克隆體系來(lái)克隆PCR產(chǎn)物。獲得大量目的DNA進(jìn)行各種分析。

PCR產(chǎn)物的TA克隆4PCR應(yīng)用應(yīng)用：

非常廣泛

各種生命現(xiàn)象的生理、病理機(jī)制的研究疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)等5常用的幾種改進(jìn)PCR方法1）

巢式引物PCR是一種增加PCR反應(yīng)特異性的方法。為二輪PCR。第一輪擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物稀釋?zhuān)鳛榈诙喎磻?yīng)的起始DNA模板。第二輪PCR需另設(shè)反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的引物（位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)）。巢式引物PCR采用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，其中第二對(duì)引物位于第一對(duì)引物內(nèi)側(cè)P1上P1RP2上P2RP1FP2F以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二步PCR，只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段，才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。達(dá)到增效、提高產(chǎn)物特異性的目的。2）多重PCR

同一PCR反應(yīng)體系中加入數(shù)對(duì)引物，可同時(shí)擴(kuò)增多種DNA片段。要求：引物復(fù)性溫度相近；所覆蓋的區(qū)域不重疊；擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同。應(yīng)用:同時(shí)檢測(cè)同一基因內(nèi)多個(gè)外顯子缺失

在檢測(cè)基因同時(shí)設(shè)置內(nèi)對(duì)照。

3）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）：原理：提取組織細(xì)胞總RNA，用oligo-dT或隨機(jī)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將其中mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA作為模板，通過(guò)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因。實(shí)驗(yàn)需設(shè)內(nèi)對(duì)照，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子。應(yīng)用：檢測(cè)基因表達(dá)水平，屬于半定量檢測(cè)。獲取目的基因的cDNA：用于合成cDNA探針或構(gòu)建表達(dá)載體等4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime–PCR):指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)