學(xué)病毒感染的檢查方法和防治原則

學(xué)病毒感染的檢查方法和防治原則第一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日1）掌握病毒的分離培養(yǎng)方法；2）熟悉標(biāo)本的采集與送檢原則、病毒感染的快速診斷；3）了解病毒感染的免疫預(yù)防、抗病毒治療。學(xué)習(xí)要求第二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)容第一節(jié)病毒感染的檢查方法第二節(jié)病毒感染的特異性預(yù)防第三節(jié)病毒感染的治療第三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)病毒感染的檢查方法第四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日一、標(biāo)本的采集與運(yùn)送病人急性期標(biāo)本標(biāo)本＋抗生素抑制細(xì)菌真菌繁殖病變組織加入50％甘油緩沖鹽水低溫保存，盡快送檢。－70℃保存血清標(biāo)本：在發(fā)病初期和發(fā)病后2～3W各取一份血清，對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。第五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日:?

病毒的分離培養(yǎng)?

病毒的鑒定?

病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定第六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日病毒的分離培養(yǎng)方法：

動(dòng)物接種雞胚培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng):第七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑴動(dòng)物接種(animalinoculation)動(dòng)物：鼠、兔、猴、黑猩猩等優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物體內(nèi)常帶有潛伏病毒。目前已很少應(yīng)用。第八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑵雞胚培養(yǎng)(embryonatedeggculture)受精卵孵育9-14天雞胚接種病毒孵育2-7天收獲相應(yīng)的材料進(jìn)行鑒定第九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日雞胚接種部位：尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種第十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日ChickembryoinoculationChickembryoinoculation第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日Allantoicinoculationisdonemainlyforproductionofvaccineofinfluenzavirus.主要用于流感病毒疫苗的生產(chǎn)第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日Viralreplicationproducesvisiblelesions(pocks),grey-whiteareainthetransparent(透明的)allantoic(尿囊的)membrane.Poxvirusinoculateinallantoicmembrane痘病毒絨膜尿囊膜接種第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：易管理不帶微生物成本較低缺點(diǎn)：操作程序復(fù)雜目前用雞胚培養(yǎng)的病毒主要是流感病毒⑵雞胚培養(yǎng)(embryonatedeggculture)第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日(3)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的方式分:

單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayercellculture）

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspendedcellculture）第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、染色體特征及傳代次數(shù)分:

原代培養(yǎng)細(xì)胞二倍體細(xì)胞株傳代細(xì)胞系或株(3)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日①原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturalcells)組織組織塊分散的單個(gè)細(xì)胞單層細(xì)胞剪碎蛋白酶(原代細(xì)胞)單層細(xì)胞(次代細(xì)胞)傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日①原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturalcells)epithelialcells第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn):?對(duì)多種病毒敏感?生長(zhǎng)能力有限,獲取成本高?可攜帶潛伏病毒應(yīng)用:?病毒分離與鑒定?病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究?不能用于制備疫苗①原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturalcells)第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日體外分裂50~100代仍保持二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞特點(diǎn):?對(duì)多種病毒敏感?不帶異種蛋白(人源性)?

不帶病毒,無(wú)致瘤潛能應(yīng)用:?病毒分離與鑒定?病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究?

制備疫苗②二倍體細(xì)胞株(diploidcellstrain)fibroblasticcells第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日③傳代細(xì)胞系(continuouscellline)特點(diǎn):?對(duì)多種病毒敏感性高?繁殖能力強(qiáng),傳代時(shí)間長(zhǎng)?有致癌危險(xiǎn)(來(lái)源于癌細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞株)應(yīng)用:?病毒分離與鑒定?病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究?不能用于制備疫苗能在體外無(wú)限傳代的細(xì)胞系。如HeLa,Hep-2epithelioidcells第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日:?

病毒的分離培養(yǎng)?

病毒的鑒定?

病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日病毒鑒定：

病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)

病毒形態(tài)學(xué)鑒定

病毒抗原鑒定

病毒基因鑒定第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑴細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)

病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起特有的細(xì)胞病變。

第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日①CPE：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日SyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).

②CPE：病毒感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞融合第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日③CPE：形成包涵體（inclusionbody）第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.⑵紅細(xì)胞吸附（hemadsorption,HAd）受染細(xì)胞膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受體第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑶干擾現(xiàn)象（interference）風(fēng)疹病毒＋人胚腎細(xì)胞病毒增殖，CPE（－）?？刹《荆伺吣I細(xì)胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚腎細(xì)胞風(fēng)疹病毒？?？刹《綜PE(-)——?？刹《?+)

風(fēng)疹病毒(+)CPE(+)——埃可病毒(+)

風(fēng)疹病毒(-)

第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日⑷細(xì)胞代謝的改變細(xì)胞培養(yǎng)瓶代謝變化-PH第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)紅細(xì)胞吸附病毒干擾作用細(xì)胞代謝的改變第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日病毒鑒定：

病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)

病毒形態(tài)學(xué)鑒定

病毒抗原鑒定

病毒基因鑒定第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日:?

病毒的分離培養(yǎng)?

病毒的鑒定?

病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：50%組織細(xì)胞感染量蝕(空)斑形成試驗(yàn)病毒總量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝試驗(yàn)第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日50%組織細(xì)胞感染量

(50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)概念:

測(cè)定病毒感染細(xì)胞后引起50%細(xì)胞病變的最小病毒量。方法:一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋?zhuān)謩e接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以能使50%細(xì)胞感染的病毒的最高稀釋度作為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量。用途:

測(cè)定感染性病毒的量和毒力第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋度的HCMV感染的HEL細(xì)胞50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaqueassay）

原理：適當(dāng)濃度的感染性病毒在覆蓋瓊脂的細(xì)胞層上產(chǎn)生可見(jiàn)和可數(shù)的局部病灶稱(chēng)為蝕斑。一個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的，由蝕斑的數(shù)目可以計(jì)算出原始標(biāo)本中感染性病毒的含量。第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日分別為10-1、10-2、10-3倍稀釋度的HCMV病毒液感染的HEL細(xì)胞蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaqueassay）

第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日用途：?測(cè)定感染性病毒量

單位:PFU(plaqueformingunit)/ml

由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的一個(gè)空斑稱(chēng)為空斑形成單位。?分純病毒蝕(空)斑形成試驗(yàn)（plaqueassay）

第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日?已知抗原—測(cè)抗體（診斷）?已知抗體—測(cè)抗原（鑒定病毒屬、種、

型、亞型）三.病毒感染的血清學(xué)診斷第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日(1)中和試驗(yàn)(Neutralizationtest)(2)血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibitiontest)(3)免疫標(biāo)記法(FIA、EIA、RIA)⑷

蛋白印跡(Westernblot)方法：三.病毒感染的血清學(xué)診斷第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日Immunofluorescensetest第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日ImmunofluorescensetestPositiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日HEL細(xì)胞中CMVIE1蛋白的表達(dá)Enzymeimmunoassay(EIA)第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日ELISAColouredwellsindicatereactivity第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日AIDS的確診試驗(yàn)Westernblot第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日數(shù)小時(shí)內(nèi)出結(jié)果形態(tài)學(xué)檢查病毒成分（抗原或核酸）早期抗體檢測(cè)（IgM）四.病毒感染的快速診斷第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）形態(tài)學(xué)檢查電鏡和免疫電鏡檢查普通光學(xué)顯微鏡檢查

包涵體第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日電子顯微鏡：可觀察各種病毒的形態(tài)但設(shè)備貴、操作復(fù)雜，應(yīng)用受限光學(xué)顯微鏡：可觀察大病毒（痘病毒）和包涵體對(duì)一般病毒檢測(cè)意義不大第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日呼腸病毒感染回腸上皮細(xì)胞電鏡照片Electronmicrographs第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日InclusionbodyCytomegaliccell

thatcontainsadense,"owl'seye,"acidophilicintranuclearinclusionbody

Negrybody第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（二）病毒成分檢測(cè)1.病毒蛋白抗原檢測(cè)

免疫標(biāo)記技術(shù)2.病毒核酸檢測(cè)

核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)

基因測(cè)序第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日（三）早期抗體檢測(cè)

可診斷急性感染

特異性IgM抗體：孕婦感染風(fēng)疹病毒

檢測(cè)早期抗原抗體是快速診斷的另一途徑

EBV早期抗原抗體第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日香港大學(xué)專(zhuān)家：患者鼻咽標(biāo)本→Vero細(xì)胞培養(yǎng)→CPE→EM觀察：冠狀病毒隨后加拿大和美國(guó)CDC等SARS國(guó)際協(xié)作組的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也培養(yǎng)出了冠狀病毒利用‘免疫熒光法’將分離病毒與SARS患者血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)呈陽(yáng)性從冠狀病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出了冠狀病毒基因→測(cè)序→經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性為64%左右SARS冠狀病毒的分離和鑒定第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日加拿大專(zhuān)家完成了全基因組測(cè)序→發(fā)現(xiàn)與已知人和動(dòng)物的冠狀病毒的同源性差異較大→確定為一種新的冠狀病毒。荷蘭的病毒學(xué)家：用這種冠狀病毒感染猴子→出現(xiàn)了與SARS病人相同的臨床表現(xiàn)和病理特征→再次從動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起SARS的病原體是這種冠狀病毒W(wǎng)HO將其命名為SARS冠狀病毒SARS冠狀病毒的分離和鑒定第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)病毒感染特異性預(yù)防第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日

微生物及其代謝產(chǎn)物

生物制品

動(dòng)物免疫血清（biologicalproducts）免疫細(xì)胞

細(xì)胞因子

預(yù)防和治療感染性疾病第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日滅活疫苗（inactivatedvaccine）活疫苗（livingvaccine）重組載體疫苗（recombinantcarriervaccine）亞單位疫苗（subunitvaccine）化學(xué)提取或人工合成疫苗重組疫苗（recombinantvaccine）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）一、人工主動(dòng)免疫常用生物制品第六十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日二、人工被動(dòng)免疫常用生物制品

免疫球蛋白

血清丙種球蛋白

細(xì)胞免疫制劑

IFN-α、β、γ細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12TNF、CSF

淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞

——LAK細(xì)胞

第六十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)病毒感染的治療第六十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，2022年，8月28日1．抗病毒的化學(xué)制劑：目前抗病毒化學(xué)藥物主要有核苷類(lèi)藥物。（1）核苷類(lèi)藥物：通過(guò)阻抑子代病毒基因的合成與表達(dá)，抑制病毒復(fù)制.常用藥物有:用于DNA病毒感染:阿糖腺苷、碘尿苷、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷（阿昔洛韋）、丙氧鳥(niǎo)苷；用于HIV感染:疊氮脫氧胸苷（AZT）廣譜抗病毒:3-氮唑核苷，對(duì)多種RN