第七章-花藥和花粉培養(yǎng)

第七章花藥和花粉培養(yǎng)一、概述（一）概念花藥培養(yǎng):把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上,使其中的花粉發(fā)育成單倍體植株的過程.花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng)):從花藥中分離出花粉粒,使之成為分散的或游離狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化,進而發(fā)育成完整植株的過程.花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲得植物單倍體的有效方法之一二倍體(diploid)植物其單倍體（haploid）即一倍體（monoploid）如，玉米2n=2x=20n=x=10；水稻2n=2x=24n=x=12四倍體(tetraploid)植物其haploid為dihaploid如，馬鈴薯2n=4x=48，n=2x=24六倍體(hexaploid)植物其haploid為triploid如，普通小麥2n=6x=42，n=3x=21八倍體(octoploid)植物其haploid為tetraploid如，草莓2n=8x=56，n=4x=28單倍體(haploid)——指具有配子染色體數(shù)的植物個體.

體細胞染色體數(shù)減半；單倍體植物與二倍體相比較，有三個明顯的特點：

生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；

雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代。

（二）花藥或花粉培養(yǎng)在作物育種中的作用：供體植株小孢子（N）花粉培養(yǎng)花粉植株（N）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株（2N）（1）縮短育種年限：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需1-2年。一年內(nèi)獲得純系例：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

（2）提高了目標基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb例：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花粉培養(yǎng)

（2）提高了目標基因型的選擇效率

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

（3）誘變育種中的作用

（4）利于篩選隱性突變體提高誘變效率

（5）利于獲得優(yōu)良植株

花藥的結(jié)構(gòu)及花粉管的形成花藥的結(jié)構(gòu)及花粉粒的發(fā)育2NN減數(shù)分裂

四分體4個單核花粉粒（細胞壁薄、細胞質(zhì)濃、核位于細胞中央）

營養(yǎng)細胞（大）單核花粉粒（單核靠邊期）（兩者僅以質(zhì)膜相隔）精細胞生殖細胞（?。┯薪z分裂

（2-細胞花粉粒）精細胞

(3-細胞花粉粒）雙核早期（三）花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的異同點培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)。花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，單倍體產(chǎn)量高，但技術(shù)難度大?；ㄋ?植物的雄性生殖器官(器官培養(yǎng))花粉:由花藥中的花粉母細胞經(jīng)減數(shù)后形成的單倍體細胞(細胞培養(yǎng)).（一）研究歷史：首先報道通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學者Guha和Maheshwari(1964,1966)。1996年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,已有至少250多種植物花藥培養(yǎng)成功。

花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應用。二、花藥培養(yǎng)技術(shù)（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇－適當?shù)念A處理—剝?nèi)』ㄋ?、接種、培養(yǎng)—形成花粉植株—花粉植株的染色體加倍—煉苗移栽外植體的選擇：供試材料的遺傳背景，供試材料的生理狀態(tài)，花粉的發(fā)育時期等。1、外植體的選擇1）適宜的基因型2）適宜的生理狀態(tài)：幼年、生長健壯、大田生長條件下的花藥誘導頻率相對要高3）花藥中花粉的發(fā)育時期：單核花粉粒時期

四分體4個單核花粉粒（細胞壁薄、細胞質(zhì)濃、核位于細胞中央）

營養(yǎng)細胞（大）單核花粉粒（單核靠邊期）（兩者僅以質(zhì)膜相隔）精細胞生殖細胞（?。┯薪z分裂

（2-細胞花粉粒）精細胞

(3-細胞花粉粒）雙核早期

選擇花藥時，一般通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。最常用的方法有醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色。

為便于快速判斷并獲取適宜發(fā)育時期的花藥培養(yǎng)材料，常采用染色法集合外部形態(tài)對比觀察方法2、預處理低溫預處理：不同材料對低溫的溫度及處理時間是不同的其它預處理方法：離心預處理、乙烯利預處理、高溫預處理處理的目的：增強花粉粒細胞的同步化3、在適宜的條件下培養(yǎng)花藥1）消毒、剝?nèi)』ㄋ帲罕苊饣ㄋ幨艿綋p傷，因為損傷常會刺激花藥壁組織的發(fā)育，形成二倍體的愈傷組織。2）接種培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基：

N6：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物的花藥培養(yǎng)

B5、MS、White、Nitch等。

C17（王培等，1986）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高出愈率。激素：相對較低的激素水平蔗糖：碳源；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，一般用量2-3%

番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導反應蔗糖濃度2％3％4％6％10％13％

17％

誘導頻率5％10％12％18％25％45％

8％溫度柑橘在20°C以下，完全不能形成胚狀體，且愈傷組織形成亦很少，當將溫度提高到21～25°C時便會有胚狀體形成，而當溫度提高到26°C以上時又完全不能形成胚狀體。油菜若將接種后的花藥在30°C條件下培養(yǎng)2～3天，可顯著提高花粉胚的形成率，小麥在33°C條件下培養(yǎng)3～5天，可提高成愈率和綠苗率光照：先弱后強培養(yǎng)方式液體培養(yǎng)：液體懸浮，或添加有利花粉胚懸浮的基質(zhì)（如30%ficoll)雙層培養(yǎng)：固體-液體雙層培養(yǎng)花藥花粉分步培養(yǎng)：條件培養(yǎng)：利用預先培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基進行花藥培養(yǎng)，可使花藥培養(yǎng)的效率大大提高。

1）胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。4、花粉植株的形態(tài)發(fā)生煙草花藥培養(yǎng)——通過胚狀體途徑再生形成小植株

1）胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2）愈傷組織發(fā)育途徑：小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復雜。2）、花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式5、單倍體植株鑒定和染色體加倍單倍體植株的鑒定1）形態(tài)學鑒定2）染色體分析單倍體植株的二倍化：0.02-0.4%的秋水仙素愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)的愈傷化發(fā)生途徑三、花粉培養(yǎng)（一）花粉培養(yǎng)的優(yōu)勢1）花粉培養(yǎng)可以排除花藥培養(yǎng)中藥壁、藥隔和花絲等體細胞的干擾；2）花粉數(shù)量多，培養(yǎng)需要的器皿和空間較小；3）花粉具有單細胞性、單倍性和較高的同步性。（二）花粉培養(yǎng)技術(shù)1、取材時期：四分體時期到單核早期。2、花粉的分離：3、小孢子純化：對獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子4、花粉的培養(yǎng)1）自然散落法(漂浮培養(yǎng)自然釋放法)：將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2）機械游離法

a.磁攪拌法：用磁力攪拌器低速攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；

b.擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。花粉培養(yǎng)方法1、直接培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、預培養(yǎng)：花藥在液體培養(yǎng)基中先培養(yǎng)2-4d，然后擠出花粉，經(jīng)離心洗滌后懸浮于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3、雙層培養(yǎng)：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基（加入失活花藥的浸提液），凝固后，在其上接種密度為1*104的花粉懸浮液，接種量以1mm層厚為宜。4、看護