第二十一章microRNA檢測技術(shù)在臨床的應(yīng)用

本章主要學(xué)習(xí)內(nèi)容和要求主要學(xué)習(xí)內(nèi)容要求

miRNA概念與特點

常用miRNA檢測與定量的方法

掌握

第二十一章microRNA檢測技術(shù)在臨床的應(yīng)用miRNA生物合成與功能miRNA檢測在腫瘤診斷中的應(yīng)用

熟悉了解miRNA檢測在神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷中應(yīng)用

miRNA檢測在心血管系統(tǒng)疾病診斷中應(yīng)用

上一頁下一頁返回第一節(jié)概述

一、

miRNA概念與特點

(一)miRNA概念

miRNA是一類進(jìn)化上保守的單鏈非編碼小分子RNA，定位于RNA前體的3‘端或5’端，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的功能。上一頁下一頁返回第一節(jié)概述

一、

miRNA概念與特點

（二）miRNA基本特征

1.結(jié)構(gòu)特征

2.miRNA的存在形式

3.保守性

4.時空特異性上一頁下一頁返回第一節(jié)概述

一、

miRNA概念與特點

（三）不同生物的miRNA特點

植物與動物miRNA的區(qū)別

上一頁下一頁動物植物前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)短，簡單長，復(fù)雜，折回長度變異明顯加工過程先在細(xì)胞核內(nèi)，后再細(xì)胞質(zhì)僅在細(xì)胞核內(nèi)作用機(jī)制大部分作為翻譯阻遏子，小部分導(dǎo)致靶mRNAs的降解大部分介導(dǎo)靶mRNAs的降解長度21-23nt21nt保守性高更高返回第一節(jié)概述

一、

miRNA概念與特點

（四）miRNA與siRNA的比較

1.miRNA與siRNA相同之處（1）二者的長度都約在22nt左右。（2）二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點:5＇端磷酸，3＇端均有2個游離核苷酸。（3）miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。（4）二者都是RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)組分，都具有組成RISC復(fù)合體的Argonaute蛋白家族，其功能界限已變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊。上一頁下一頁返回第一節(jié)概述

一、

miRNA概念與特點

（四）miRNA與siRNA的比較

2.miRNA和siRNA區(qū)別：（1）根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，在基因組中有固定的基因座位；siRNA可以是人工體外合成的，也可以是基因組的轉(zhuǎn)錄片斷，降解片斷和轉(zhuǎn)座片斷，病毒基因組轉(zhuǎn)錄片斷等，。（2）二者結(jié)構(gòu)上沒有本質(zhì)區(qū)別，功能分子都是單鏈RNA，miRNA轉(zhuǎn)錄出來時必然是發(fā)夾狀的，siRNA可以由完全互補(bǔ)的雙鏈切斷而來，也可以從發(fā)夾來。（3）本質(zhì)區(qū)別在于作用位點上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位點，一般在靶基因3′-UTR區(qū)，而siRNA由于是隨機(jī)產(chǎn)生的或者人工設(shè)計的，因此作用位點可以設(shè)計或改變，可作用于mRNA的任何部位。（4）在作用方式上，沒有本質(zhì)區(qū)別，是否降解或翻譯抑制取決于互補(bǔ)程度，siRNA也可抑制靶標(biāo)基因的翻譯。（5）miRNA的生理功能在于調(diào)控發(fā)育分化和調(diào)亡，適時調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，而siRNA是生物抵抗外來核酸片斷入侵的一種方式，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。上一頁下一頁返回第一節(jié)概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

上一頁下一頁1miRNA生物合成過程

在細(xì)胞核內(nèi)，基因組DNA轉(zhuǎn)錄生成較長的RNA分子（可長達(dá)1000nt），被雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Drosha

切割成長度大約70-100堿基的、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子（前體microRNA）。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA通過核輸出蛋白exportin5機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，然后被第二個雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Dicer切割，得到19-23nt大小的成熟的miRNAs

產(chǎn)物。返回第一節(jié)概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

上一頁下一頁

miRNA生物合成過程

返回第一節(jié)概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

上一頁下一頁2miRNA在基因組分布

獨立表達(dá)的miRNAs

成簇表達(dá)的miRNAs

位于內(nèi)含子的miRNAs

返回第一節(jié)概述二、miRNA生物合成與功能（二）miRNA

生物學(xué)功能1.miRNA調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制上一頁下一頁miRNA調(diào)控基因表達(dá)兩種機(jī)制miRNA調(diào)控蛋白翻譯

miRNA調(diào)控mRNA降解返回第一節(jié)概述

二、miRNA生物合成與功能（二）miRNA

生物學(xué)功能

2.miRNA調(diào)控基因表達(dá)的特征與優(yōu)點（1）miRNA調(diào)控基因表達(dá)的特點

1）交叉調(diào)節(jié);2）自我調(diào)節(jié);3）可逆性調(diào)節(jié).（2）miRNA調(diào)控基因表達(dá)的優(yōu)點

1）與蛋白水平的調(diào)節(jié)相比，更加節(jié)省能量

2）與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)相比，miRNA

調(diào)節(jié)更迅速，而且是可逆的

3）內(nèi)含子所編碼的miRNA

是一種對基因組資源的高效利用上一頁下一頁返回第一節(jié)概述三．miRNA應(yīng)用（一）基因功能的分析（二）miRNA

功能和效應(yīng)的評價（三）新型基因治療方案的設(shè)計和發(fā)展（四）抗病毒疫苗的設(shè)計和研制（五）功能缺失轉(zhuǎn)基因動物的建立上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法一、理想的miRNA檢測與定量方法miRNA檢測

1.具有足夠的靈敏性檢測到少量的miRNA；

2.具有足夠的特異性足以分辨一個堿基差異的

miRNA；

3.能夠進(jìn)行miRNA表達(dá)的定量分析；

4.進(jìn)行多樣本平行檢測；檢測過程簡便、經(jīng)濟(jì)。上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（一）基因芯片技術(shù)

miRNAmicroarray可以檢測組織特異的miRNA,并且實驗結(jié)果可重復(fù)率高。這種微芯片不僅可以檢測miRNA的類型,還可以對其進(jìn)行定量。它可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達(dá);通過設(shè)計適當(dāng)?shù)墓押塑账崽结?同時檢測成熟的miRNA及其前體分子;miRNAmicroarray可以用于高通量的篩選miRNA,并且可以用于臨床病例的篩選。

上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（一）基因芯片技術(shù)上一頁下一頁基因芯片技術(shù)檢測miRNA表達(dá)的基本原理返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（二）熒光定量技術(shù)實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR可用于檢測miRNA的表達(dá)水平。Step-loop實時定量是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達(dá)的實驗技術(shù)，包括設(shè)計具有莖環(huán)（stemloop）結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實時PCR2個關(guān)鍵步驟。該技術(shù)有以下優(yōu)點：高度特異性，特異的step-loop反轉(zhuǎn)錄引物和探針確保反應(yīng)不受其前體及基因組DNA污染等因素的干擾，對序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數(shù)量級

上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法Step-loop反轉(zhuǎn)錄PCR檢測miRNA基本原理上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（三）克隆測序技術(shù)大多數(shù)現(xiàn)有的miRNA是通過cDNA克隆識別和鑒定出來的,這是發(fā)現(xiàn)miRNA的重要方法。構(gòu)建miRNA的cDNA文庫通常有兩種方法,

一種是將所有的RNA通過變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離回收25nt以下的小片段RNA,隨后在RNA3′和5′端連上接頭,逆轉(zhuǎn)錄后與對應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再將片段克隆至載體,最后對每個克隆進(jìn)行測序。第二種方法是分離出小片段RNA后,用poly(A)聚合酶在3′端進(jìn)行多聚腺苷酸化反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄后,再在cDNA3′端進(jìn)行鳥苷酸化反應(yīng),隨后進(jìn)行擴(kuò)增和測序,最后通過PAGE/Northernblot等予以驗證。

上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法

上一頁下一頁克隆測序技術(shù)進(jìn)行miRNA檢測的基本原理返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法

（四）原位雜交技術(shù)原位雜交(Insituhybridization)檢測miRNAs逐漸發(fā)展起來,它可以檢測候選miRNAs的短暫表達(dá)。應(yīng)用原位雜交技術(shù)可進(jìn)行石蠟包埋、福爾馬林固定的組織內(nèi)的miRNA檢測，同時可以不再分離miRNA情況下，進(jìn)行多細(xì)胞之間miRNA表達(dá)的檢測。

上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法上一頁下一頁原位雜交方法檢測miRNA的基本原理返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（五）Northern雜交技術(shù)

RNA印跡即Northernblot是最經(jīng)典的檢測真核生物RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法,可以從大量的RNA樣本中同時獲得這些信息,主要包括:①完整的RNA的分離;②根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行分離;③將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上,在轉(zhuǎn)移過程中,要保持RNA在凝膠中的相對分布;④將RNA固定到固體支持物上;⑤固相RNA與探針分子雜交;⑥除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子;⑦對特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測、捕獲和分析。

上一頁下一頁返回第二節(jié)miRNA檢測與定量方法上一頁下一頁Northern雜交技術(shù)進(jìn)行miRNA檢測的基本原理圖返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應(yīng)用

最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點（fragilesite）。這說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員將miRNA命名為“ONCOMIRs”。對患者進(jìn)行的有關(guān)oncomiR的大型高通量研究，可以對癌癥進(jìn)行新的分類，并對患者預(yù)后做出更為準(zhǔn)確的預(yù)測。

返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應(yīng)用（一）microRNA與癌癥產(chǎn)生

MicroRNAs誘發(fā)腫瘤的機(jī)制返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應(yīng)用（二）oncoMIR的表達(dá)情況與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后相關(guān)研究

miRNA

表達(dá)水平的變化,導(dǎo)致了腫瘤基因或抑癌基因轉(zhuǎn)錄后的異常調(diào)控,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。通過尋找具有癌基因和抑癌基因性質(zhì)的miRNA,可以為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標(biāo)。返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁各種腫瘤組織內(nèi)miRNA表達(dá)以及與預(yù)后的相關(guān)性

腫瘤類型miRNAS表達(dá)情況檢測方法與預(yù)后的關(guān)系腦腫瘤miR-21升高Northern雜交不清楚miR-221，miR-10b升高芯片雜交Northern雜交miR-128，miR-181a降低芯片雜交Northern雜交乳腺癌miR-21升高芯片雜交Northern雜交miR-21與miR-145表達(dá)水平與腫瘤增殖指數(shù)具有相關(guān)性miR-125b,miR-145降低芯片雜交Northern雜交結(jié)直腸腫瘤miR-143，miR-145miR-133b降低Northern雜交miR-31表達(dá)水平與腫瘤的分期有關(guān)miR-31,miR-95,miR-135b,miR-183升高定量PCR檢測返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁各種腫瘤組織內(nèi)miRNA表達(dá)以及與預(yù)后的相關(guān)性

腫瘤類型miRNAS表達(dá)情況檢測方法與預(yù)后的關(guān)系非小細(xì)胞肺癌let7降低芯片雜交定量PCR檢測Let7的低表達(dá)與miR-155高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不佳miR-126降低芯片雜交定量PCR檢測miR-21，miR-205，miR-155升高芯片雜交定量PCR檢測肝細(xì)胞腫瘤miR-18，miR-224升高芯片雜交Northern雜交miR-18表達(dá)水平與腫瘤分化成負(fù)相關(guān)miR-199a,miR-195,miR-200a,miR-125a降低芯片雜交Northern雜交甲狀腺濾泡癌miR-197,miR-346升高芯片雜交定量PCR檢測生殖細(xì)胞腫瘤miR-372,miR-373升高原位雜交返回第三節(jié)miRNA檢測的臨床應(yīng)用上一頁下一頁二、miRNA檢測在心血管系統(tǒng)疾病診斷中應(yīng)用

目前有關(guān)miRNA在心臟病理生理過程的調(diào)節(jié)作用的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展。在心臟的發(fā)生發(fā)育與分化的調(diào)節(jié)方面，小分子RNA能幫助精確調(diào)節(jié)與心臟肌肉初期發(fā)育有關(guān)的關(guān)鍵蛋白的生產(chǎn)；如miR-1能夠靶向Hand2基因的mRNA，而Hand2基因是心臟形成的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。小分子RNA適時地關(guān)閉Hand2蛋白的生成以促使心肌正常發(fā)育。同時，miR-1也是肌細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)因子的直接作用靶點。研究發(fā)現(xiàn)，在心臟的肥大過程中，miR-19