一種藥物注射劑類過敏反應(yīng)高內(nèi)涵檢測(cè)方法的初步建立

一種藥物注射劑類過敏反應(yīng)高內(nèi)涵檢測(cè)方法的初步建立類過敏反應(yīng)是藥物注射劑最常見的不良反應(yīng)，但現(xiàn)有檢測(cè)方法尚存在諸多不足。該研究采用熒光標(biāo)記和高內(nèi)涵篩選技術(shù)建立了一種類過敏反應(yīng)體外檢測(cè)方法，應(yīng)用RBL2H3細(xì)胞脫顆粒模型，以細(xì)胞膜特異熒光染料FM464標(biāo)記細(xì)胞脫顆粒囊泡回收來確定陽性細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞核特異熒光染料Hochest3334標(biāo)記細(xì)胞核來確定細(xì)胞總數(shù)，從而計(jì)算藥物刺激后的細(xì)胞脫顆粒率。為了考察高內(nèi)涵檢測(cè)方法可靠性，首先采用陽性藥物Compound48/80驗(yàn)證了高內(nèi)涵檢測(cè)方法與傳統(tǒng)過敏介質(zhì)卩氨基己糖苷酶釋放和小鼠耳廓皮膚藍(lán)染檢測(cè)方法間一致性，結(jié)果顯示高內(nèi)涵檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法高度一致，且靈敏度高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法；然后采用30批次臨床報(bào)告過敏癥狀丹紅注射液進(jìn)一步驗(yàn)證高內(nèi)涵檢測(cè)方法的可靠性，結(jié)果提示高內(nèi)涵檢測(cè)結(jié)果與臨床報(bào)告高度一致，而且高內(nèi)涵方法一定程度上能夠克服注射液自身顏色干擾問題?？梢?，類過敏反應(yīng)高內(nèi)涵檢測(cè)方法是一種靈敏、可靠、簡(jiǎn)便且可實(shí)現(xiàn)高通量篩選的新方法，適用于藥物注射劑類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)，能夠?yàn)榕R床安全用藥提供指導(dǎo)。標(biāo)簽：類過敏反應(yīng)；注射劑；高內(nèi)涵；細(xì)胞脫顆粒[Abstract]Anaphylactoidreaction（AR）isthemostcommonadversereactionofinjectionformulations，however，thereareobviousdrawbacksinavailablemethodsforARdetectionAnovelinvitrodetectionmethodforARwasestablishedbasedonfluorescentlabelingandhighcontentscreen（HCS）systeminpresentstudyWiththeuseofRBL2H3cellsdegranulationmodel，positivecellcountwasdeterminedwithspecificcellularmembranefluorescentdyeFM464labelingvesiclerecycle，andtotalcellscountwasdeterminedwithspecificnucleusfluorescentdyeHochest3334，andthentheratioofcellsdegranulationafterdrugstimulationwascalculatedInordertoverifythereliabilityofthisHCSmethod， positivedrugCompound48/80wasfirstusedtoconfirmtheconsistenceofHCSmethodwiththetraditional^hexosaminidasereleasetestandtheEvansbluestainingearstestinmiceTheresultsshowedhighconsistencebetweenHCSmethodandtraditionaltestingmethods，andtheHCSmethodshowedhighersensitivitythantheothertwotestsThen30samplesofDanhonginjection（DHI）withclinicalallergysymptomsfurtherwereusedtoconfirmthereliabilityofthisHCSmethodTheHCSresultsshowedhighconsistencewiththeclinicalreport，andtheHCSmethodhadtheadvantageinreducingtheinterferencebydrugcolorTherefore，thisHCSmethodisreliable，sensitive，simpleandhighthroughputmethodindetectionofAR，applicablefortheARevaluationofinjectionformulations，andcanprovideguidanceforsafetyofclinicalapplicationinclinicalpractice[Keywords]anaphylactoidreaction；injection；highcontentsystem；celldegranulationdoi：10.4268/cjcmm20161024類過敏反應(yīng)是藥物注射劑最常見的不良反應(yīng)。藥物注射劑因絕對(duì)生物利用度高導(dǎo)致不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)性增高［1］，據(jù)報(bào)道臨床類過敏反應(yīng)占超敏反應(yīng)的77%［2］，反映了類過敏反應(yīng)發(fā)生的廣泛性；中藥注射劑引發(fā)的過敏性休克中有3/4屬于類過敏反應(yīng)［3］，反映了類過敏反應(yīng)發(fā)生的嚴(yán)重性；因此，預(yù)測(cè)藥物注射劑類過敏反應(yīng)對(duì)指導(dǎo)臨床安全用藥非常必要。類過敏反應(yīng)是機(jī)體首次接觸類過敏原就會(huì)誘發(fā)肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,釋放過敏介質(zhì)引起過敏癥狀，有別于過敏反應(yīng)需經(jīng)致敏階段和IgE抗體介導(dǎo)，但兩者在細(xì)胞脫顆粒引起過敏癥狀方面相同，在臨床藥物不良反應(yīng)報(bào)道中常將兩者混淆［46］。目前由于類過敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)制尚不清楚，缺乏特異性檢測(cè)方法［45］，現(xiàn)有檢測(cè)方法借鑒了過敏反應(yīng)檢測(cè)，包括在體和體外檢測(cè)2類。在體檢測(cè)方法采用動(dòng)物直接給藥，通過觀測(cè)過敏癥狀、測(cè)定血清生化指標(biāo)、評(píng)價(jià)血管通透性等方式判斷類過敏反應(yīng)發(fā)生［1，45，7］，優(yōu)點(diǎn)在于接近臨床反應(yīng)狀況，是目前預(yù)測(cè)藥物類過敏反應(yīng)的常用方法，不足之處在于動(dòng)物用量大、癥狀評(píng)價(jià)主觀性強(qiáng)、不同種屬動(dòng)物對(duì)同一藥物反應(yīng)差別大、費(fèi)用高昂等。體外檢測(cè)方法采用藥物直接刺激細(xì)胞，通過檢測(cè)釋放的過敏介質(zhì)、觀測(cè)細(xì)胞脫顆粒形態(tài)改變、監(jiān)測(cè)細(xì)胞脫顆粒過程等方式判斷細(xì)胞脫顆粒的發(fā)生［78］。過敏介質(zhì)測(cè)定多采用比色法，藥物顏色對(duì)比色法測(cè)定干擾大，由于中藥注射液多數(shù)具有顏色，因而限制了其應(yīng)用；采用中性紅、甲苯胺藍(lán)和阿利新藍(lán)等染料染色計(jì)算細(xì)胞脫顆粒率，由于染料特異性低導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率低；采用透射電鏡觀察脫顆粒細(xì)胞形態(tài)改變雖然準(zhǔn)確率高，但實(shí)驗(yàn)成本高、操作復(fù)雜且不能動(dòng)態(tài)觀察，適用于研究機(jī)制但不適用于高通量篩選；采用標(biāo)記囊泡特異蛋白方法，如AnnexinV［9］或CD63［10］，特異性高但實(shí)驗(yàn)程序操作復(fù)雜，不適用于高通量篩選，因此，有必要發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏且特異的類過敏反應(yīng)高通量監(jiān)測(cè)方法來預(yù)測(cè)藥物安全性。高內(nèi)涵篩選(highcontentscreen，HCS)系統(tǒng)是基于熒光顯微成像技術(shù)進(jìn)行圖像定量分析的自動(dòng)化平臺(tái)，能夠在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整條件下檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞多種功能活動(dòng)的影響，本研究基于高內(nèi)涵平臺(tái)建立類過敏反應(yīng)檢測(cè)方法；細(xì)胞脫顆粒是類過敏反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，包括囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、定向、錨定、融合和回收等步驟［11］，本研究采用RBL2H3細(xì)胞脫顆粒模型,應(yīng)用膜特異熒光染料FM464標(biāo)記細(xì)胞脫顆粒囊泡回收，在HCS系統(tǒng)檢測(cè)藥物注射劑所導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加來反映細(xì)胞脫顆粒狀況，通過細(xì)胞核熒光染料Hochest33342標(biāo)記細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞脫顆粒率來預(yù)測(cè)類過敏反應(yīng)發(fā)生，從而建立一種預(yù)測(cè)注射劑類過敏發(fā)生的HCS檢測(cè)方法。材料與方法試劑與儀器大鼠嗜堿粒性白血病細(xì)胞(RBL2H3)(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，CatNoTCR7)；MEM酚紅(LotNo1645771)/無酚紅(LotNo1663883)培養(yǎng)基，胎牛血清(LotNo1205330)(Gibco公司)；熒光染料FM464(LotNo1614994，Invitrogen公司)；熒光染料Hoechst33342(LotNo#4082，CellSingalingTechnology公司)；Compound48/80(LotNo014M4062V)，0氨基己糖(LotNoSLBL1919V)(Sigma公司)；伊文思藍(lán)(LotNo619C047，北京索萊寶公司）；丹紅注射液（國藥準(zhǔn)字Z20026866，荷澤步長(zhǎng)制藥有限公司）；高內(nèi)涵Operetta及Harmony分析軟件（PerkinElmer公司）；FlexStation3多功能酶標(biāo)儀器（MolecularDevices公司）；48/96孔透明微孔板及96孔黑色微孔板（Corning公司）。12細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物RBL2H3細(xì)胞，在37°C,5%CO2條件下用MEM完全培養(yǎng)基（89%MEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%時(shí)按照1：5進(jìn)行傳代，約3d傳代一次。ICR小鼠，SPF級(jí)，體重20?22g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號(hào)SCXK（軍）20120004，飼養(yǎng)溫度（25±2）C，相對(duì)濕度40%?60%。本實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)由天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（TJABJY2012001）。13建立類過敏反應(yīng)HCS檢測(cè)為了建立類過敏反應(yīng)的HCS檢測(cè)方法，采用Compound48/80作為工具藥優(yōu)化高內(nèi)涵檢測(cè)條件。131優(yōu)化熒光染料FM464染色濃度和染色時(shí)間RBL2H3細(xì)胞接種于96孔黑色微孔板中培養(yǎng)24h，為了優(yōu)化染色濃度，考察FM464在10,20,40,50mg?L-1染色效果；為了優(yōu)化染色時(shí)間，F(xiàn)M464與細(xì)胞共孵育時(shí)間在15,30,45,60min時(shí)進(jìn)行HCS檢測(cè)。FM464激發(fā)波長(zhǎng)520?550nm,發(fā)射波長(zhǎng)650?760nm,在高內(nèi)涵Operetta系統(tǒng)獲得圖像信息，采用Harmony分析軟件進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)每次3個(gè)復(fù)孔，通過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=9）確定，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)除特殊強(qiáng)調(diào)外均與此相同。132優(yōu)化Compound48/80的HCS檢測(cè)濃度為了優(yōu)化Compound48/80刺激細(xì)胞脫顆粒濃度，設(shè)立對(duì)照組、Compound48/80終濃度100,150,200,500mg?L-1組，在37C與細(xì)胞共孵育30min進(jìn)行HCS檢測(cè)。采用FM464特異染色囊泡膜回收來確定陽性細(xì)胞數(shù)，采用Hoechst33342特異染色細(xì)胞核確定細(xì)胞總數(shù)，Hoechst33342激發(fā)波長(zhǎng)360?400nm,發(fā)射波長(zhǎng)410?480nm,經(jīng)HCS系統(tǒng)檢測(cè)后計(jì)算細(xì)胞脫顆粒率。為了計(jì)算細(xì)胞脫顆粒率，首先根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果［13］確定了對(duì)照組RBL2H3細(xì)胞基礎(chǔ)細(xì)胞脫顆粒率40%,與對(duì)照組有顯著性差異（圖4）,在500mg.L-1時(shí)，HCS方法檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞脫顆粒率可達(dá)到〉90%；但在Compound48/80100mg?L-l卩氨基己糖苷酶釋放率只有5%,與對(duì)照組無顯著性差異（圖5）,在500mg.L-1時(shí)只達(dá)到17%。這種現(xiàn)象可以從理論上得到解釋，細(xì)胞脫顆粒可同時(shí)釋放多種過敏介質(zhì)，包括組胺、P氨基己糖苷酶、類胰蛋白酶等，因各種過敏介質(zhì)本身釋放量不同，加之測(cè)定方法靈敏度不同，導(dǎo)致檢測(cè)單一過敏介質(zhì)卩氨基己糖苷酶釋放率有其局限性；與之相對(duì)應(yīng)，所有細(xì)胞脫顆粒過程均存在囊泡回收現(xiàn)象，采用膜特異熒光染料標(biāo)記囊泡回收現(xiàn)象，從理論上較檢測(cè)單一過敏介質(zhì)釋放率靈敏度要高。在實(shí)際工作中，采用過敏介質(zhì)釋放評(píng)價(jià)類過敏反應(yīng)常需要同時(shí)測(cè)定數(shù)種過敏介質(zhì)，增加了工作量和試驗(yàn)成本；相比而言，囊泡回收是囊泡釋放之后的關(guān)鍵步驟，采用特異細(xì)胞膜染色法較之中性紅和甲苯胺藍(lán)等染料的特異性強(qiáng)，因而可靠性和準(zhǔn)確性更高。HCS檢測(cè)方法與動(dòng)物耳廓藍(lán)染方法結(jié)論一致，證實(shí)了HCS方法的可靠性，由于兩者劑量單位不同，無法比較兩者間靈敏度高低，但顯然基于細(xì)胞水平的HCS檢測(cè)方法比動(dòng)物耳廓藍(lán)染方法在動(dòng)物使用、操作便捷和高通量篩選方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。30批次臨床報(bào)告過敏癥狀DHI樣品HCS檢測(cè)結(jié)果與臨床觀察結(jié)果符合率在866%，考慮到臨床報(bào)告過敏癥狀樣品的實(shí)際情況較復(fù)雜，其中可能包括了類過敏、過敏反應(yīng)或藥物毒性反應(yīng)等情況，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果屬于與臨床觀察符合度較高水平。測(cè)試樣品自身顏色是比色法測(cè)定的重要干擾因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HCS方法抗干擾能力強(qiáng)于比色法。過敏介質(zhì)測(cè)定多用比色法，包括組胺Elisa檢測(cè)法、卩氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶檢測(cè)法等，由于中藥注射液多數(shù)具有顏色，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在嚴(yán)重干擾，本研究在測(cè)定臨床報(bào)道過敏癥狀DHI樣品對(duì)卩氨基己糖苷酶釋放率影響時(shí)，確證了DHI自身顏色，尤其在稀釋倍數(shù)低時(shí)對(duì)測(cè)試結(jié)果存在嚴(yán)重干擾，因此比色法在這種情況下的應(yīng)用受到限制。HCS檢測(cè)方法同樣受到測(cè)試樣品自身顏色干擾，在DHI樣品測(cè)試中，本研究采用考察正常DHI樣品對(duì)FM464熒光強(qiáng)度影響，計(jì)算出不同稀釋倍數(shù)DHI降低FM464熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換系數(shù)，用于確定同等條件下脫顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，從而獲得類過敏反應(yīng)樣本在同樣稀釋倍數(shù)下的脫顆粒陽性細(xì)胞數(shù)，基于DHI初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示熒光檢測(cè)法比光譜吸收比色法在對(duì)抗測(cè)試樣品自身顏色干擾能力強(qiáng)，提示HCS檢測(cè)方法適用范圍可能較比色法更廣泛，同時(shí)考慮到中藥注射液化學(xué)成分復(fù)雜，需要結(jié)合具體研究對(duì)象進(jìn)行系統(tǒng)考察?？傊?，Compound48/80結(jié)果顯示HCS方法結(jié)論與傳統(tǒng)過敏介質(zhì)檢測(cè)方法卩氨基己糖苷酶釋放率、整體動(dòng)物耳廓藍(lán)染反應(yīng)結(jié)論高度一致，證明高內(nèi)涵檢測(cè)方法可靠；基于30批次臨床報(bào)告過敏癥狀DHI樣品檢測(cè)結(jié)果證實(shí)HCS方法與臨床觀察結(jié)果高度一致，表明HCS方法能夠用于預(yù)測(cè)藥物臨床類過敏反應(yīng)。因此，本研究建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏、高通量檢測(cè)藥物注射劑的類過敏反應(yīng)高內(nèi)涵檢測(cè)方法。[參考文獻(xiàn)]⑴李佳，黃芝瑛注射用輔料類過敏反應(yīng)的非臨床評(píng)價(jià)方法[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33（1）：9.SzeheniJ.Complementactivationrelatedpseudoallergy：anewclassofdruginducedacuteimmunetoxicity[J].Toxicology， 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