基因工程重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

基因工程重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞第五章重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞第一節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞第二節(jié)重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞2021/4/272第一節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌2021/4/2731.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第一節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞2021/4/274使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種2021/4/2752021/4/276用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理2021/4/2774.制備過(guò)程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸2021/4/278二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)（3）轉(zhuǎn)染（transfection)1.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)2021/4/279轉(zhuǎn)化：通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。轉(zhuǎn)化(transformation)2021/4/2710轉(zhuǎn)導(dǎo)：當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來(lái)，再次感染另一受體細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)2021/4/2711轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。由transformation（轉(zhuǎn)化）和infection（感染）兩詞構(gòu)成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)感染方式將外來(lái)DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染。將任何類型DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程均可叫轉(zhuǎn)染。2021/4/2712例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。轉(zhuǎn)化（transformation)2021/4/2713λ噬菌體的生活史例轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)2021/4/2714每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法2021/4/271510ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法2021/4/2716LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法2021/4/27174.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過(guò)夜2021/4/2718環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素2021/4/2719目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連2021/4/2720①生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜增加通透性。④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)2021/4/2721把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）2021/4/2722cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。但當(dāng)溫度升高到44℃—45℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。（2）cI857基因突變的噬菌體2021/4/2723噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（3）互補(bǔ)型噬菌體外殼蛋白基因D發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體22021/4/2724E基因突變只合成尾部蛋白和包裝識(shí)別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的載體DNA體外包裝成活性噬菌體2021/4/2725(4)體外包裝過(guò)程2021/4/2726體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（5）轉(zhuǎn)導(dǎo)2021/4/27272021/4/2728第二節(jié)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞二、導(dǎo)入植物細(xì)胞三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞2021/4/2729轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合）。第二節(jié)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his312021/4/2730（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化2021/4/2731

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG（聚乙二醇）（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化2021/4/2732葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk)2021/4/2733植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)2021/4/2734又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）2021/4/2735基因槍2021/4/2736（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。2021/4/2737不需要載體。