輻射損傷中代謝組學(xué)的研究綜述,核醫(yī)學(xué)論文

輻射損傷中代謝組學(xué)的研究綜述,核醫(yī)學(xué)論文隨著核能及放射技術(shù)在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們的工作和日常生活不可避免的會接觸輻射，輻射造成的損傷也日益遭到關(guān)注。輻射流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期低劑量輻射會出現(xiàn)頭暈、乏力、記憶力減退等異常感覺和狀態(tài)[1-5],大劑量輻射會造成造血、胃腸、神經(jīng)血管和皮膚等一個或多個系統(tǒng)損傷，引起神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)調(diào)節(jié)障礙，毀壞機體組織的蛋白質(zhì)、核酸和酶等引起機體物質(zhì)代謝紊亂[6-7].輻射損傷是多層次、多步驟、多階段的復(fù)雜經(jīng)過[8],當(dāng)前迫切需要對其損傷機制和早期診斷進行研究。代謝組學(xué)是指通過考察生物體系〔細(xì)胞、組織或生物體〕受刺激或擾動后〔如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后〕，其代謝產(chǎn)物〔內(nèi)源性代謝物質(zhì)〕種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的學(xué)科[9].當(dāng)前輻射損傷在基因水平和細(xì)胞水平已經(jīng)進行了廣泛的研究，但由于其損傷的復(fù)雜性和終端表象的差異性，對輻射損傷的研究仍沒有突破性進展。基于輻射損傷最終都會導(dǎo)致終端代謝物的一系列變化，通過代謝組學(xué)技術(shù)在整體代謝水平上研究輻射損傷的發(fā)生、發(fā)展機制，有助于我們發(fā)現(xiàn)可用于輻射損傷早期診斷、療效評估和預(yù)后的標(biāo)志物。本文就近年代謝組學(xué)在輻射損傷中的研究做一綜述。1代謝組學(xué)研究方式方法代謝組學(xué)研究流程主要包括樣品采集與前處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)分析3個步驟。1.1代謝組學(xué)樣品采集與前處理代謝組學(xué)的研究對象廣泛，當(dāng)前對體液〔血液、尿液、腦脊液等〕，組織，細(xì)胞培養(yǎng)液等的樣品采集和前處理均發(fā)表了相關(guān)操作規(guī)程[10-14].華而不實應(yīng)用于輻射損傷的研究樣本多為尿液和血液〔血清和血漿〕。研究學(xué)者通常根據(jù)檢測代謝物個數(shù)的不同將代謝組學(xué)分為靶標(biāo)代謝組學(xué)和非靶標(biāo)代謝組學(xué)[15].靶標(biāo)代謝組學(xué)是指一定數(shù)量的代謝物的定性、定量分析；非靶標(biāo)代謝組學(xué)是指無偏見的測量和比擬盡可能多的代謝物。當(dāng)前對于輻射代謝組學(xué)的研究大部分局限于非靶標(biāo)代謝組學(xué)機制探尋求索階段，進一步的靶標(biāo)代謝組學(xué)生物標(biāo)志物驗證研究仍存在缺乏。1.2代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集技術(shù)當(dāng)前，代謝組學(xué)研究主要的數(shù)據(jù)采集技術(shù)為基于核磁共振光譜〔NMR〕和質(zhì)譜〔MS〕的檢測技術(shù)。華而不實應(yīng)用最廣的為NMR、液相色譜質(zhì)譜連用〔LC-MS〕和氣相色譜和質(zhì)譜連用〔GC-MS〕技術(shù)，各類檢測技術(shù)均有其優(yōu)缺點。代謝組學(xué)是基于NMR技術(shù)發(fā)展起來的一門學(xué)科，NMR對生物樣品的選擇廣泛，不需要復(fù)雜的樣品前處理，對樣品無毀壞性，檢測無偏向性，但對酸堿度、離子濃度、溫度都很敏感，分析靈敏度低、譜圖重疊互相干擾，導(dǎo)致圖譜解析困難。GC-MS是分析揮發(fā)性化合物的一種高效技術(shù)，適用于GC-MS分析的化合物必須是可揮發(fā)的或是經(jīng)過衍生化可揮發(fā)的化合物。GC-MS分析速度快，靈敏度高的特點有利于微量物質(zhì)的分析，較高的柱效加上適宜的梯度升溫能夠?qū)⒔^大多數(shù)的峰形加以分離以用于定量；以較完好的譜庫為基礎(chǔ)的構(gòu)造分析軟件為未知物質(zhì)的定性提供了極大的便利。GC-MS技術(shù)最大的缺陷是往往需要對樣品進行預(yù)處理，對生物樣品中的原始信息造成了干擾，不利于代謝組學(xué)的全譜分析。LC-MS相對于GC-MS能夠分析較高極性和較大分子量的化合物，并且樣品無需衍生化處理。隨著超高效液相色譜〔UPLC〕和高分辨質(zhì)譜〔Q-TOF/MS和LTQ/Orbitrap等〕的出現(xiàn)，為復(fù)雜生物樣品提供了更好的分離能力和構(gòu)造鑒定能力。當(dāng)前，有些研究常采用多種技術(shù)進行聯(lián)合檢測，進行分析方式方法的整合，來提高檢測數(shù)據(jù)的全面性。1.3代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析一般包括：數(shù)據(jù)預(yù)處理、形式辨別、代謝物鑒定和生物標(biāo)志物驗證。數(shù)據(jù)預(yù)處理主要包括濾噪、峰辨別、重疊峰解析、峰對齊、峰補齊和歸一化等。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后，得到的二維數(shù)據(jù)矩陣用于形式辨別。形式辨別包括無監(jiān)督學(xué)習(xí)方式方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方式方法。無監(jiān)督學(xué)習(xí)方式方法是將所得分類信息和樣品的原始信息比擬，找出差異不同，其不需要任何有關(guān)樣本類別的知識，直接從己有數(shù)據(jù)中獲得樣本的類別歸屬。主要包括：主成分分析，層次聚類分析，自組織圖、聚類分析。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方式方法是利用多參數(shù)模型對樣品進行辨別和分類，其需要事先獲得樣本的分類信息，利用已經(jīng)知道類別的樣本作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)建立和優(yōu)化有關(guān)分類模型，以對后續(xù)新樣本的類別進行預(yù)測。主要包括：判別分析、偏最小二乘法、偏最小二乘-判別分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。2代謝組學(xué)在輻射損傷研究中的應(yīng)用輻射是由不同能量的電磁波尤其是、射線等高能電磁波，、粒子、超熱中子等放射性粒子以及鈾、氡、钚等放射性同位素引起的一種能量傳遞方式[16].通常根據(jù)輻射頻率及作用形式分為電離輻射和非電離輻射。電離輻射是指能引起被作用物質(zhì)電離的輻射。對于生物組織來講，電離輻射的危害性很大，由于造成危害的主要是量子能量，而不是總能量，因而，即便在低功率照射下，也會產(chǎn)生累積效應(yīng)，造成生物組織的毀壞與損傷。非電離輻射一般不引起物質(zhì)分子的電離，只導(dǎo)致分子的振動、轉(zhuǎn)動或電子能激狀態(tài)的改變，因而非電離輻射的量子能量缺乏以毀壞分子，它對生物體的毀壞與損傷，取決于其總能量，即必須在高功率和一定的照射時間下才能發(fā)生。非電離輻射會使生物體在沒有明顯升溫的條件下，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等功能紊亂。當(dāng)前代謝組學(xué)在輻射損傷的研究大都集中于電離輻射損傷，對非電離輻射損傷研究較少。2.1代謝組學(xué)在電離輻射研究中的應(yīng)用射線輻射生物體后，生物機體產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基產(chǎn)生太多而不能及時去除時就會引起一系列的輻射損傷[17-20].四氫生物蝶呤〔BH4〕是一氧化氮合酶〔NOS〕的重要輔助因子。其缺乏將導(dǎo)致NOS解耦聯(lián)，生成自由基O2-,O2-能與NO反響，生成ONOO-,ONOO-是一種很活潑的陰離子，能夠毀壞酶的構(gòu)造和功能，引起細(xì)胞損傷。有研究者采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了非致死劑量的電離輻射在過表示出GTPH-1反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中的代謝情況[21-22],發(fā)現(xiàn)BH4的相對含量在輻射組明顯較低，并發(fā)現(xiàn)了一系列與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化有關(guān)的代謝物。Ahmad等[23]采用1HNMR對射線輻射的小鼠尿液和血清進行代謝組學(xué)分析，在5Gy照射后的小鼠尿液中，檸檬酸鹽、-酮戊二酸、丁二酸、馬尿酸、三甲胺與非照射組相比具有明顯差異，通過相關(guān)的代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)射線輻射擾亂了腸道微生物菌群的生長和機體能量代謝，血清研究還發(fā)現(xiàn)射線輻射損傷與脂質(zhì)代謝、能量代謝紊亂有關(guān)。機體遭到輻射作用后，血細(xì)胞的增殖、分裂功能下降，血細(xì)胞來源減少，白細(xì)胞下降，骨髓造血功能障礙[24].基于此，采用射線全身大劑量照射可建立血虛證模型?；舫萚25]采用60Co射線3.5Gy照射劑量全身1次性照射小鼠建立小鼠血虛證模型，并以四物湯連續(xù)7d灌胃給藥進行干涉。采用NMR技術(shù)檢測血清、胸腺、脾臟以及股骨上段骨髓組織提取液觀察其代謝譜的變化。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、肌酐、磷酸化膽堿、膽堿、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白等在正常組與輻射損傷所致血虛證組代謝波動較大，給予四物湯干涉后相關(guān)化合物具有轉(zhuǎn)歸趨勢。輻射損傷所致血虛證的機制可能與機體無氧氧化功能受損、能量代謝和脂類代謝失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)外浸透壓平衡遭到毀壞以及機體免疫功能失調(diào)有關(guān)。IdleJR課題組對射線輻射生物標(biāo)志物進行了一系列系統(tǒng)研究。該課題組首先采用兩個強度的射線〔3Gy和8Gy〕照射小鼠，收集小鼠照射前和照射后24h的尿液進行UPLC-Q-TOF/MS代謝組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)尿液中胸苷的相對含量在射線照射組明顯高于非照射組[26].隨后，該課題組又進一步研究了射線低劑量照射〔1Gy,2Gy,3Gy〕小鼠尿液代謝輪廓隨強度的變化。研究發(fā)現(xiàn)，包括胸苷和2-脫氧尿苷在內(nèi)的脫氨嘌呤類和嘧啶類具有照射劑量和照射時間相關(guān)性[27].考慮到尿液中一些高極性化合物在UPLC系統(tǒng)中不保存不易分離，該課題組又采用GC-MS方式方法對射線照射的大鼠尿液代謝產(chǎn)物進行了分析，發(fā)現(xiàn)尿液中乙醛酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶、檸檬酸鹽、2-酮戊二酸等的相對含量在照射組與非照射組明顯不同。胸腺嘧啶和尿嘧啶由于是胸苷和2-脫氧尿苷的衍生物，與前期研究結(jié)果具有一致性。通過代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，射線照射可能影響機體氧化應(yīng)激和腎功能水平[28-30].通過UPLC-Q-TOF/MS大鼠尿液代謝組學(xué)分析，又進一步證實了上述化合物作為射線輻射損傷嚙齒類動物生物標(biāo)志物的可能性[31].為了進一步的將嚙齒類實驗數(shù)據(jù)與臨床研究相關(guān)聯(lián)，該課題組又對靈長類動物獼猴進行尿液輻射代謝組學(xué)研究[32].研究發(fā)現(xiàn)?；撬?、黃嘌呤、尿酸、肌酐等13個化合物對聚類奉獻明顯，并對這些化合物進行了進一步的靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，明確了其在輻射組與對照組之間的含量差異，并通過受試者工作特征曲線〔ROC曲線〕評估了其模型判別的準(zhǔn)確性。然而在對前期潛在標(biāo)志物進行靶標(biāo)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些化合物均沒有顯著差異，分析結(jié)果一方面可能是由于物種之間差異的影響，另一方面提示我們非靶標(biāo)代謝組學(xué)查找到的生物標(biāo)記物需進一步經(jīng)過定量驗證來評估其準(zhǔn)確性。2.2代謝組學(xué)在非電離輻射研究中的應(yīng)用隨著微波技術(shù)的廣泛應(yīng)用，微波輻射作為非電離輻射的常見形式也逐步得到關(guān)注。長期遭到微波輻射的人員會出現(xiàn)精神抑郁、失眠、疲憊、頭痛、沖動、多夢、記憶力下降等異常感覺和狀態(tài)[33].王麗峰等[34]采用NMR代謝組學(xué)研究了微波輻射對獼猴尿液中代謝產(chǎn)物的影響。經(jīng)5和11mM/cm2微波單次輻射和4.68W/cm2微波30d累積輻射均能引起尿液代謝產(chǎn)物的變化，其差異代謝物包括馬尿酸、檸檬酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、肌酐、?；撬岷捅奖彼岬?。這些代謝物質(zhì)牽涉三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物、氨基酸遞質(zhì)代謝產(chǎn)物等，其功能主要牽涉線粒體、神經(jīng)遞質(zhì)等，提示低劑量微波長期輻射和高劑量微波一次性輻射均對機體代謝產(chǎn)生影響。3瞻望代謝組學(xué)應(yīng)用于輻射損傷的研究還處于初級階段，仍然有很多問題需要解決。從最近幾年輻射代謝組學(xué)相關(guān)文獻來看，代謝組學(xué)在輻射損傷中的研究，大多集中于生物標(biāo)志物的探尋求索階段，在機制研究方面仍比擬欠缺。從代謝組學(xué)的研究手段上來講，絕大部分仍停留在非靶標(biāo)代謝組學(xué)的輪廓分析，對生物標(biāo)志物的靈敏度與準(zhǔn)確性沒有進行進一步的定量驗證，進而缺乏有的效講服力。同時，從上述分析中還能夠發(fā)現(xiàn)，研究者沒有將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與病理生理學(xué)研究結(jié)果進行有效的結(jié)合，在造模階段缺乏有效的病理學(xué)數(shù)據(jù)進行支撐，在生物標(biāo)志