【課件】3.2基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第節(jié)2基因工程的基本操作程序高中生物選擇性必修3第3章闡明基因工程的原理和基本操作程序。針對(duì)人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物學(xué)習(xí)目標(biāo)一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因例如，與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因等。2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（一）人工合成（DNA合成儀）（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（三）從基因文庫(kù)中獲?。ㄒ唬┩ㄟ^(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。DNA合成儀1、概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。

整個(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，故又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、PCR利用的原理是什么？DNA復(fù)制（二）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（常用）3、方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）

指數(shù)2n（2）4種脫氧核苷酸(dNTP)

（5）一對(duì)引物：（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）（1）DNA模板(需含有目的基因)

5、條件：引物是一段核苷酸序列，與目的基因的起始段互補(bǔ)。有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。4、前提：（4）溫度控制IMN變性復(fù)性延伸PCR擴(kuò)增過(guò)程是怎樣的？PCR過(guò)程（三次）925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因925575℃變性3`5`5`3`925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物的___________延伸，合成與模板互補(bǔ)的___________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5′端→3′端測(cè)一測(cè)（三）從基因文庫(kù)中直接獲?。ㄍ卣梗?.什么是基因文庫(kù)？2.按外源DNA片段的來(lái)源分類基因文庫(kù)分為哪幾類？種類基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)3.建構(gòu)基因文庫(kù)的目的是什么？為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需要的目的基因？★基因文庫(kù)的構(gòu)建（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）基因組文庫(kù)（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。

基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA——核心二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_________。（2）用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。

科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:開(kāi)闊眼界：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：開(kāi)闊眼界：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)1、基因表達(dá)載體的組成：2、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：2、分類（一）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（二）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞

（三）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞

目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程。受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（一）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（采用最多）（2）基因槍法（3）花粉管通道法1、方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（采用最多）①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是什么？②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于那些植物？1、方法：顯微注射法（采用最多；最有效）（二）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞2、操作的程序是怎樣的？1、為什么選用微生物作為受體細(xì)胞？（三）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞2、操作的程序是怎樣的？3、什么是感受態(tài)細(xì)胞？用什么處理得到？2023/2/2四、目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道。1.分子水平的檢測(cè)（1）PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標(biāo)記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因插入成功或轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。2023/2/2（2）抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。2.個(gè)體生物學(xué)水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常2023/2/21.在實(shí)際種植過(guò)程中，棉鈴蟲(chóng)是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？到社會(huì)中去

科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的抗蟲(chóng)性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周?chē)嬖诖罅刻烊槐幼o(hù)所，靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種。2023/2/22.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？到社會(huì)中去

科研人員想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性和抗蟲(chóng)持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲(chóng)基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲(chóng)基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲(chóng)棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲(chóng)活性，又可以延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過(guò)不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲(chóng)范圍。（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國(guó)等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基2023/2/2到社會(huì)中去因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周?chē)N植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周?chē)辽俜N植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國(guó)除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場(chǎng)需設(shè)計(jì)專門(mén)的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長(zhǎng)江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲(chóng)寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無(wú)須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。這樣做的原理是為少部分害蟲(chóng)提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲(chóng)種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲(chóng)交配，后代抗性基因會(huì)發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲(chóng)的種群也不至于迅速增加。（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。2023/2/2探究·實(shí)踐·DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一）實(shí)驗(yàn)原理1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。（2）PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。（2）PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。（3）凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL2023/2/2（二）材料用具1.試劑：（1）無(wú)菌水、瓊脂糖；（2）電泳緩沖液（TAE或TBE）；（3）凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。（5）PCR反應(yīng)體系的配方2023/2/22.用具：（1）PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）；（2）微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）；（3）微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）；（4）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）；（5）電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）1.DNA片段的擴(kuò)增移液用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據(jù)目的片段長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間2023/2/2（三）方法步驟預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相2023/2/22.DNA片段的電泳鑒定2023/2/2（四）注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買(mǎi)，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。2023/2/2結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過(guò)低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等?？偨Y(jié):基因工程的基本操作程序獲取目的基因人工合成利用PCR從基因文庫(kù)構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；思考探究2、利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？

有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因，如綠色熒光蛋白基因等3、β-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。當(dāng)堂檢測(cè)1.

下列不屬于獲得目的基因的方法的是（）從基因文庫(kù)中獲取B.利用人工合成法獲得C.利用PCR技術(shù)大量獲得D.利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得 【答案】D【解析】基因工程中獲取目的基因的方法有三種：從基因文庫(kù)中獲取目的基因、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因、人工合成法（包括反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）獲得目的基因。2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述若干次循環(huán)：90℃以上使模板DNA解聚為單鏈→50℃左右下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR反應(yīng)過(guò)程的敘述中，不正確的是（）A.變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B.復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成C.延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D.PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比，所需要酶的最適溫度較高【答案】C【解析】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，相當(dāng)于DNA的大量復(fù)制。所以在形成新的DNA過(guò)程中，所需要的原料是四種脫氧核苷酸。A.基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建B.基因表達(dá)載體的構(gòu)建并不一定相同C.圖中啟動(dòng)子位于目的基因的首端，是核糖體識(shí)別和結(jié)合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因 【答案】C【解析】由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有所差別，不可能是千篇一律的；啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。3.

下圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)基因工程中載體的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是（）4.下圖是利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是（）A.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異B.③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲(chóng)基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀D.②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與 【答案】A【解析】⑤為轉(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就說(shuō)明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達(dá)了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A項(xiàng)正確；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T-DN