X3-1-4 蛋白質(zhì)工程的崛起

11.4蛋白質(zhì)工程的崛起專題1基因工程2一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由

通過基因工程能夠大規(guī)模生產(chǎn)生物體內(nèi)微量存在的活性物質(zhì)，并借助轉(zhuǎn)基因而改變動植物性狀，得以在人類醫(yī)療保健中進行基因診斷和基因治療。然而在廣泛利用自然界各種蛋白質(zhì)的過程中就發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)只是適應(yīng)生物自身的需要，而對它們進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白質(zhì)工程，它是指按照特定的需要，對蛋白質(zhì)進行分子設(shè)計和改造的工程。自此以后，蛋白質(zhì)工程迅速發(fā)展，已成為生物工程的重要組成部分。3

在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。4

例如：干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進行表達，產(chǎn)生的干擾素的抗病毒活性為106U/mg，只相當(dāng)于天然產(chǎn)品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形式存在。為什么會這樣？如何改變這種狀況？研究發(fā)現(xiàn)，β-干擾素蛋白質(zhì)中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸，結(jié)果使大腸桿菌中生產(chǎn)的β-干擾素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外-70℃可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍改造改造5倍2倍61、基因工程的應(yīng)用（1）基因工程的實質(zhì)：將一種生物的

轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，使后者產(chǎn)生本不能產(chǎn)生的

，進而表現(xiàn)出新的

。（2）基因工程的不足：在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的

。2、天然蛋白質(zhì)的不足天然蛋白質(zhì)是生物在長期

過程中形成的，它們的

符合特定物種

的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。3、蛋白質(zhì)工程的目的生產(chǎn)符合人類生產(chǎn)和生活的需要的

?；虻鞍踪|(zhì)性狀蛋白質(zhì)進化結(jié)構(gòu)和功能生存蛋白質(zhì)7“后基因組時代”將是“蛋白質(zhì)組學(xué)時代”，即從對基因信息的研究轉(zhuǎn)向?qū)Φ鞍踪|(zhì)信息的研究，包括研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用及蛋白質(zhì)相互關(guān)系和作用。蛋白質(zhì)工程就是在對蛋白質(zhì)的化學(xué)、晶體學(xué)、動力學(xué)等結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識的基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化的產(chǎn)品。8二、蛋白質(zhì)工程的基本原理基因DNAmRNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄翻譯生物功能預(yù)期功能折疊分子設(shè)計DNA合成蛋白質(zhì)工程中心法則流程圖9例1.科學(xué)家將β－干擾素基因進行定點突變導(dǎo)入大腸桿菌表達，使干擾素第17位的半胱氨酸改變成絲氨酸，結(jié)果大大提高了β－干擾素的抗病活性，并且提高了儲存穩(wěn)定性。該生物技術(shù)為A.基因工程B.蛋白質(zhì)工程C.基因突變D.細胞工程B10蛋白質(zhì)工程的概念基礎(chǔ):實質(zhì)：途徑:目標(biāo):蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能基因修飾或基因合成

改造或制造新的蛋白質(zhì)，滿足人類的生產(chǎn)或生活的需要是對編碼蛋白質(zhì)的基因進行改造11例2.以下關(guān)于蛋白質(zhì)工程的說法正確的是（）A、蛋白質(zhì)工程以基因工程為基礎(chǔ)B、蛋白質(zhì)工程就是酶工程的延伸C、蛋白質(zhì)工程就是用蛋白酶對蛋白質(zhì)進行改造D、蛋白質(zhì)工程只能生產(chǎn)天然的蛋白質(zhì)A12蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了

解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);（4）設(shè)計各種處理條件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。13異亮氨酸半胱氨酸14基因定點誘變技術(shù)的示意圖15基因定點誘變技術(shù)的理解(蘇教版)項目內(nèi)容條件原料酶引物能量

ＡＴＰ操作方法

ＰＣＲ法結(jié)果適應(yīng)范圍后代中半數(shù)為誘變的ＤＮＡ分子脫氧核苷酸ＤＮＡ聚合酶和ＤＮＡ連接酶含突變順序的ＤＮＡ分子片段空間結(jié)構(gòu)完全清楚的蛋白質(zhì)16思考：基因定點誘變技術(shù)與基因突變的比較比較基因定點誘變基因突變相同點發(fā)生的過程結(jié)果不同點場所手段方向DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生新基因，從而產(chǎn)生新性狀生物體外生物體內(nèi)定向改造不定向性PCR技術(shù)物理化學(xué)方法171、目標(biāo)：根據(jù)人們對

功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的

進行分子設(shè)計。2、原理：改造基因（基因

或基因

）。3、途徑：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計

→推測應(yīng)有的

序列→找到對應(yīng)的

序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾合成預(yù)期的蛋白質(zhì)氨基酸脫氧核苷酸

對天然蛋白質(zhì)進行改造，你認(rèn)為直接對蛋白質(zhì)分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？18（一）蛋白質(zhì)的分子設(shè)計與改造蛋白質(zhì)工程首先是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和溶液構(gòu)象的研究，積累了成千上萬蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資料，并編制成系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，得以從中找出蛋白質(zhì)分子間的進化關(guān)系、一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面的規(guī)律。19

蛋白質(zhì)作為生物大分子是生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究重點，大量蛋白質(zhì)被分離純化，測定了它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物學(xué)作用。分子生物學(xué)有關(guān)基因組的研究，也可以用以推測出一些未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。采用定位誘變的方法，可以對編碼蛋白質(zhì)的基因進行核苷酸密碼子的插入、刪除、置換和改組，其結(jié)果為分子改造提供新的設(shè)計方案?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)是生物長期進化的結(jié)果，蛋白質(zhì)工程則是對生物進化的模擬，按照蛋白質(zhì)形成的規(guī)律，改造蛋白質(zhì)或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)。20

蛋白質(zhì)的改造通常需要先經(jīng)周密的分子設(shè)計，然后依賴基因工程獲得突變型蛋白質(zhì)，以檢驗其是否達到了預(yù)期的效果。如果改造的結(jié)果不理想，還需要重新設(shè)計再進行改造，往往經(jīng)歷多次實踐摸索才能達到改進蛋白質(zhì)性能的預(yù)定目標(biāo)。21（二）蛋白質(zhì)改造工程舉例1．水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，由65或66個氨基酸殘基組成。水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設(shè)計方案，將47位的Asn（天冬酰胺）變成Lys（賴氨酸），使其與分子內(nèi)第4或第5位Thr（蘇氨酸）間形成氫鍵來幫助水蛭素N端肽段的正確取向，從而提高凝血效率，試管試驗活性提高4倍，在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果，提高20倍。222．生長激素改造生長激素通過對它特異受體的作用促進細胞和機體的生長發(fā)育，然而它不僅可以結(jié)合生長激素受體，還可以結(jié)合許多種不同類型細胞的催乳激素受體，引發(fā)其他生理過程。在治療過程中為減少副作用，需使人的重組生長激素只與生長激素受體結(jié)合，盡可能減少與其他激素受體的結(jié)合。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者受體結(jié)合區(qū)有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過改造加以區(qū)別。由于人的生長激素和催乳激素受體結(jié)合需要鋅離子參與作用，而它與生長激素受體結(jié)合則無需鋅離子參與，于是考慮取代充當(dāng)鋅離子配基的氨基酸側(cè)鏈，如第18和第21位His（組氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。實驗結(jié)果與預(yù)先設(shè)想一致，但要開發(fā)作為臨床用藥還有大量的工作要做。233．胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素β23-β28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，如β28位改為賴氨酸、β29位改為脯氨酸，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。244．治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；藥物保護正常細胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它結(jié)構(gòu)類似物磷酸化而使這些堿基3’-OH缺乏,從而阻斷DNA的合成，殺死癌細胞。HSV—TK催化能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機突變中進行篩選出一種酶,在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力20倍以上。25

蛋白質(zhì)工程的發(fā)展很快，研究工作很多，以上僅介紹了幾個例子。蛋白質(zhì)工程除了用于改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計制造新的蛋白質(zhì)外，其本身還是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種強有力的工具，它在解決生物理論方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并論。26例3.干擾素是動物體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，可以用來治療病毒的感染和癌癥，但在體外保存相當(dāng)困難，如何長期保存，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)干擾素中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，可以保存半年。你來設(shè)想一下，能不能讓動物生產(chǎn)能夠長期儲存的干擾素？采用什么方法？

能生產(chǎn)長期儲存的干擾素。用氨基酸序列反推信使RNA序列，再反推DNA序列，然后進行基因改造。27何謂蛋白質(zhì)工程？

在現(xiàn)代生物技術(shù)中，蛋白質(zhì)工程出現(xiàn)得最晚，是在20世紀(jì)80年代初期出現(xiàn)的。1983年“蛋白質(zhì)工程”這個名詞出現(xiàn)后，隨即被廣泛接受和采用。蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。28

對照密碼表，至少寫出三種決定“—丙氨酸—色氨酸—賴氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—”的脫氧核苷酸序列。討論（1）mRNA序列為：

GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）脫氧核苷酸序列：

CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）（2）確定目的基因的堿基序列后，就可以根據(jù)人類的需要改造它，通過人工合成的方法或從基因庫中獲取。29起始密碼30比較項目基因工程蛋白質(zhì)工程程序上合成的是否是自然蛋白質(zhì)順著中心法則逆著中心法則是不是蛋白質(zhì)工程和基因工程的區(qū)別31項目蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別原理中心法則的逆推基因重組過程預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→推測脫氧核苷酸序列→合成DNA→表達出蛋白質(zhì)獲取目的基因→構(gòu)建表達載體→導(dǎo)入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品(基因的異體表達)結(jié)果生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì)生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質(zhì)聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程，因為對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新的蛋白質(zhì)，必須通過基因修飾或基因合成實現(xiàn)重組創(chuàng)新321.進展胰島素速效型藥品2.前景制作電子元件3.現(xiàn)狀蛋白質(zhì)工程目前成功的例子不多,原因是對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)了解不夠。要設(shè)計出更加符合人類需求的蛋白質(zhì)還需經(jīng)過艱辛的探索。應(yīng)用于微電子方面具耗電少和

的特點體積小效率高三、蛋白質(zhì)工程的進展和前景如β28位改為賴氨酸、β29位改為脯氨酸，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。33例4.某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能很相似，只有對熱穩(wěn)定性較差，進入人體后容易失效?，F(xiàn)要將此酶開發(fā)成一種片劑，臨床治療食物的消化不良，最佳方案是A.對此酶中的少數(shù)氨基酸替換，以改善其功能B.將此酶與人蛋白酶進行拼接，形成新的蛋白酶C.重新設(shè)計與創(chuàng)造一種全新的蛋白酶D.減少此酶在片劑中的含量A341、下列關(guān)于蛋白質(zhì)工程的說法錯誤的是A．蛋白質(zhì)工程能定向改造蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，使之更加符合人類的需要B．蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對蛋白質(zhì)分子直接進行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)C．蛋白質(zhì)工程能產(chǎn)生出自然界中不曾存在過的新型蛋白質(zhì)分子D．蛋白質(zhì)工程與基因工程密不可分，又被稱為第二代基因工程B練習(xí)353、下列各項中不屬于蛋白質(zhì)工程在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的是（）A.基因芯片用于HIV診斷B.t-PA用于醫(yī)治心肌梗死C.速效胰島素用于治療糖尿病D.人—鼠嵌合抗體用于識別、殺傷腫瘤細胞2、蛋白質(zhì)工程中直接需要進行操作的對象是A．氨基酸結(jié)構(gòu)B．蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)C．肽鏈結(jié)構(gòu)D．基因結(jié)構(gòu)DA364、蛋白質(zhì)工程的基本流程正確的是①蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)設(shè)計②DNA合成③預(yù)期蛋白質(zhì)功能④根據(jù)氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列A．①②③④B．④②①③C．③①④②D．③④①②C375、蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，其結(jié)果產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是A．氨基酸種類增多B．氨基酸種類減少C．仍為天然存在蛋白質(zhì)D．可合成天然不存在蛋白質(zhì)D386、枯草桿菌產(chǎn)生的蛋白酶具有催化分解蛋白質(zhì)的特性，但極易被氧化而失效。1985年，美國的埃斯特爾將枯草桿菌蛋白酶分子中的第222位氨基酸替換后，雖然其水解活性有所下降，但抗氧化能力大大提高。用這種水解酶作為洗滌劑的添加劑，可以有效地除去血漬、奶漬等蛋白質(zhì)污漬。（1）改造枯草桿菌蛋白酶的生物技術(shù)是

。（2）改造后的枯草桿菌中的控制合成蛋白酶的基因與原來相比，至少有

個堿基對發(fā)生變化。（3）利用生物技術(shù)改造蛋白質(zhì)，是提高了蛋白質(zhì)的

性，埃斯特爾所作的工作是對已知蛋白質(zhì)進行

。蛋白質(zhì)工程1穩(wěn)定少數(shù)氨基酸的替換39思考與探究（P28）1.解析：蛋白質(zhì)工程的崛起主要是工業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)理論研究的需要。而結(jié)構(gòu)生物學(xué)對大量蛋白質(zhì)分子的精確立體結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的生物功能的分析結(jié)果，為設(shè)計改造天然蛋白質(zhì)提供了藍圖。分子遺傳學(xué)的以定點突變?yōu)橹行牡幕虿僮骷夹g(shù)為蛋白質(zhì)工程提供了手段。在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大