核酸合成轉(zhuǎn)錄

14.1轉(zhuǎn)錄(transcription)的特點(diǎn)：

1、以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。轉(zhuǎn)錄的條件：模板原料酶產(chǎn)物配對(duì)方向引物DNA(不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）NTPRNA聚合酶mRNA,tRNA,rRNA，小RNAA-U,T-A,G-C5’3’不需要第1頁/共52頁DNA的大小與基因結(jié)構(gòu)基因(structuregene)：

DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段

1、重復(fù)

2、重疊

3、不連續(xù)第2頁/共52頁2、DNA的不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

.DNA雙鏈上，僅一股鏈轉(zhuǎn)錄，另一股不轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄方向5’3’模板鏈圖13-1第3頁/共52頁模板鏈：

反意義鏈（antisensestrand，(-)鏈）

——

以該鏈中的DNA堿基順序指導(dǎo)RNA的合成即被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈。

編碼鏈：有意義鏈（sensestrand，（+）鏈）

——不被轉(zhuǎn)錄的那條DNA鏈，但其堿基順序除T代替U外，其余與mRNA相同。

第4頁/共52頁5’-----GCAGTACATGTC-----3’編碼鏈

DNA3’-----CGTCATGTACAG-----5’模板鏈5’-----GCAGUACAUGUC-----3’mRNAN------Ala--Val--His--Val------C蛋白質(zhì)有意義鏈與反意義鏈并非固定不變。

.轉(zhuǎn)錄方向都是5’3’第5頁/共52頁

3、RNA聚合酶——依賴DNA的RNA聚合酶

（DNA-dependentRNApolymerase,DDRP）

以DNA為模板，催化2個(gè)游離的NTP形成3’，5’-磷酸二酯鍵第6頁/共52頁14.2.1大腸桿菌RNA聚合酶的組成（1）全酶(holoenzyme)

由4種(5個(gè))亞基α2ββ’σ組成（2）核心酶(coreenzyme)

α2ββ’

，參與轉(zhuǎn)錄的全過程（3）σ亞基（起始亞基）亦稱σ因子（σfactor)—轉(zhuǎn)錄輔助因子

識(shí)別啟動(dòng)子

ω亞基功能未知14.2原核生物的轉(zhuǎn)錄第7頁/共52頁大腸桿菌RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)示意圖核心酶(α2ββ)起始因子β——和模板DNA結(jié)合β——起始和催化聚合反應(yīng)α——酶的裝配、結(jié)合啟動(dòng)子等全酶(α2ββ

)第8頁/共52頁全酶核心酶亞基α2ββ’σ決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄結(jié)合底物，形成磷酸二酯鍵（催化）結(jié)合模板（開鏈）（核心酶參與轉(zhuǎn)錄全過程）識(shí)別起始點(diǎn)啟動(dòng)子（延長(zhǎng)時(shí)脫落）功能第9頁/共52頁第10頁/共52頁14.2.2原核生物的啟動(dòng)子（promoter）

1、啟動(dòng)子

RNA聚合酶全酶識(shí)別、結(jié)合、開始轉(zhuǎn)錄的DNA序列（雙鏈）

轉(zhuǎn)錄因子

RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所需要的輔助因子（蛋白質(zhì)）

第11頁/共52頁

原核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn):

(1)DNA序列在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5’端區(qū)(上游區(qū))

(2)-10bp處-TATAAT-(Pribnowbox)

(3)-35bp處-TTGACA-

第12頁/共52頁14.2.3原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄過程14.2.3.1模板的識(shí)別第13頁/共52頁14.2.3.2原核生物的轉(zhuǎn)錄起始σ亞基辨認(rèn)-35區(qū)RNApol全酶移向-10區(qū)合成第一個(gè)磷酸二酯鍵5’-pppGpN（A）-OH-轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物RNApol(αββ′σ)—DNA—pppGpN-OHσ亞基脫落（結(jié)合松弛）（結(jié)合緊密）轉(zhuǎn)錄起始不需引物！16/50第14頁/共52頁RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因終止點(diǎn)10-10TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄開始+1翻譯開始Purine-35（Pribnowbox）辨認(rèn)結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)12/50編碼鏈第15頁/共52頁RNA聚合酶σ因子識(shí)別及結(jié)合啟動(dòng)子，延長(zhǎng)時(shí)脫落不參與轉(zhuǎn)錄過程，是轉(zhuǎn)錄輔助因子識(shí)別位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子-35區(qū)、-10區(qū)第16頁/共52頁結(jié)合過程：閉和的啟動(dòng)子復(fù)合體RNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA雙鏈上迅速、隨機(jī)滑動(dòng)，尋找到啟動(dòng)子-35區(qū)，形成疏松的復(fù)合物，DNA雙鏈未解開。開放的啟動(dòng)子復(fù)合體RNA聚合酶（全酶）移向-10區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始第17頁/共52頁14.2.3.3延長(zhǎng)----轉(zhuǎn)錄泡

RNA聚合酶（核心酶）

◆與DNA模板緊密結(jié)合，沿3’5’方向移動(dòng)

◆解旋作用：DNA解開

◆聚合功能（不具外切酶功能）

雜交螺旋

◆RNA-DNA形成雜交螺旋

◆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA沿5’3’方向延長(zhǎng)

第18頁/共52頁第19頁/共52頁第20頁/共52頁SeeMovie第21頁/共52頁14.2.3.4轉(zhuǎn)錄終止：終止子和終止因子

轉(zhuǎn)錄至模板某一位置

停止形成磷酸二酯鍵

RNA—DNA雜交鏈解開

DNA解鏈的部分重新形成雙螺旋

RNA聚合酶離開DNA

第22頁/共52頁終止子（terminator）——提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列終止因子（terminationfactor）——協(xié)助RNAPol識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子第23頁/共52頁第24頁/共52頁第一類：

依賴ρ-因子的終止1、轉(zhuǎn)錄終止的兩種方式（原核）第25頁/共52頁第26頁/共52頁

DNA模板上有終止信號(hào)

轉(zhuǎn)錄出來的RNAPol遇此結(jié)構(gòu)停止工作DNA和RNA（dA：rU）穩(wěn)定性下降富含GC/AT的回文結(jié)構(gòu)自身互補(bǔ)形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)（hairpin）3’尾端有≥4個(gè)UDNA恢復(fù)雙鏈，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第二類：不依賴ρ-因子的終止第27頁/共52頁UUGCAGCCUGAGAAAUCAGGCUGAUGG…5’3’…5’3’自發(fā)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’末端）例如：第28頁/共52頁AUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU5’3’UUUU……5’3’自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)第29頁/共52頁發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)莖多個(gè)U

DNA模板

3’5’第30頁/共52頁第31頁/共52頁起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段53RNA啟動(dòng)子Promoter

終止子terminator5RNA聚合酶5353553離開第32頁/共52頁

轉(zhuǎn)錄后的加工

第33頁/共52頁14.2.4.1原核生物mRNA多順反子轉(zhuǎn)錄與翻譯同步mRNA不需加工

壽命短第34頁/共52頁14.2.4.1tRNA的加工堿基修飾3’端5’端切除反密碼環(huán)的內(nèi)含子稀有堿基---Tψ脫氨---AMPIMP還原---DHU甲基化---mAmGCCA-OHRNaseP切除多余的核苷酸RNaseP在前tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上第35頁/共52頁第36頁/共52頁14.2.4.3

rRNA的加工第37頁/共52頁RNaseⅢRNaseⅢRNaseE甲基化堿基甲基化核糖第38頁/共52頁14.3真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

1、轉(zhuǎn)錄與翻譯在異處第39頁/共52頁14.3.1真核細(xì)胞RNA聚合酶在DEAE-Sephadex柱上的洗脫次序稱為酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

沒有對(duì)應(yīng)于σ因子的成分，需要轉(zhuǎn)錄因子參與第40頁/共52頁14.3.2啟動(dòng)子（Hongness盒–25）TATA框（Hognessbox）與RNA聚合酶的定位有關(guān)

DNA雙鏈解開的部位輔助因子為通用轉(zhuǎn)錄因子（generaltranscriptionfactor，GTF）第41頁/共52頁

4、真核與原核生物mRNA的區(qū)別原核生物mRNA多順反子轉(zhuǎn)錄與翻譯同步mRNA不需加工

壽命短真核生物mRNA單順反子轉(zhuǎn)錄后需加工運(yùn)至胞漿再翻譯mRNA需加工壽命較長(zhǎng)第42頁/共52頁

真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：hnRNA（核不均一RNA）

+

蛋白質(zhì)不均一核糖核蛋白（hnRNP）第43頁/共52頁加帽加尾mRNA前體的剪接5’端：m7GpppGpN作用:穩(wěn)定mRNA5’端和翻譯的起始有關(guān)3’端:polyA尾巴作用：穩(wěn)定mRNA

和翻譯模板活性有關(guān)剪除內(nèi)含子，連接外顯子加工過程主要包括：第44頁/共52頁5pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶5m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM5ppGp…磷酸酶Pi（1）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工--“加帽”以5’-5’三磷酸相連第45頁/共52頁步驟1步驟2作用位置200~250（2）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工--加polyA尾第46頁/共52頁外顯子內(nèi)含子DNA

hnRNA（3）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工—剪接第47頁/共52頁mRNA-DNAhybridsforthechickenovalbumingene(theR-loopingtechnique)第48頁/共52頁●14.4核酶---真核生物rRNA的自身剪切

四膜蟲

26SrRNA核酶（ribozyme）應(yīng)用

前體6.4kb414bp內(nèi)含子

5.986kb

無酶催化，自身剪接具有催化功能的RNA

切割特異性RNA序列具特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)---槌頭結(jié)構(gòu)人工合成核酶的槌頭結(jié)構(gòu)破壞HIV病毒

第49頁/共52頁底物催化部分圖13-11第50頁/共52頁酶底物圖13-12第51頁/共52頁DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的比較相同點(diǎn)模板兩股鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄合成方式半保留復(fù)制不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄原料

dNTPNTP