核酸生物合成

第十章核酸的生物合成第一節(jié)DNA的生物合成生物體內(nèi)的合成主要包括三個方面：1.在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行的DNA復(fù)制，親代細(xì)胞通過DNA自身復(fù)制將遺傳信息傳給子代；2.當(dāng)體內(nèi)DNA受到某些損傷時，可以進(jìn)行修復(fù)；3.在某些病毒中存在的以RNA為模板的DNA合成。一、參與DNA復(fù)制的酶及蛋白因子（一）DNA聚合酶（DNApolymerase）以dNTP為底物，以DNA為模板，需要一段引物，從引物的3-OH末端合成DNA新鏈。三種大腸桿菌DNA聚合酶1.DNA聚合酶I(1956,ArthurKornberg)外切酶活性：3′5′外切活性具有校正作用；

5′3′切除引物和DNA損傷的修復(fù)；聚合作用：合成速度較慢，每秒10個核苷酸，而且新鏈長20個核苷酸后，酶即脫離模板?？莶輻U菌蛋白酶68kDa35kDa大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（修復(fù)酶）

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ不具有5’-3’外切活性聚合酶Ⅰ補(bǔ)大缺口；聚合酶Ⅱ補(bǔ)小缺口2.DNA聚合酶Ⅱ

外切酶活性：3′5′外切活性

聚合作用：

5′3′補(bǔ)小缺口（<100核苷酸）3.DNA聚合酶III

大分子寡聚酶，10種亞基組成,含Zn2+，400kD,是大腸桿菌DNA復(fù)制的主要酶。Slidingclampsubunits聚合酶活性聚合酶活性3’5’外切活性γ復(fù)合物，促進(jìn)β亞基二聚體轉(zhuǎn)移并結(jié)合于DNA雙螺旋DNApolIII

（復(fù)制酶）

促進(jìn)核心酶形成二聚體組裝防止核心酶從模板DNA上滑落α亞基有5′3′外聚合活性ε亞基有3′5′外切活性θ亞基刺激ε外切活性組成核心酶

酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈，還可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修復(fù)DNA鏈DNA聚合酶Ⅲ與酶Ⅰ作用類似，酶活高，是主要的鏈延伸酶（聚合酶replicase）（二）DNA連接酶（DNAligase)DNA雙螺旋中一條鏈有缺口，并且3’-OH與5’-P相鄰特異性不高，在DNA不連續(xù)復(fù)制、重組及損傷修復(fù)中起作用哺乳動物：ATP輔酶，大腸桿菌：NAD輔酶，都需要Mg2+連接方式：酶先與ATP或NAD形成酶—AMP，酶—AMP與5’-P形成焦磷酸而活化

（三）與解除DNA高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子1.解螺旋酶催化DNA雙螺旋解鏈；依賴DNA單鏈存在，對單鏈親和力強(qiáng)；依賴ATP水解提供能量向著雙螺旋方向移動。（三）與解除DNA高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子2.拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)湫再|(zhì)—物體或圖像做彈性移動時保持物體圖像不變的性質(zhì)。DNA三級結(jié)構(gòu)具有拓?fù)湫再|(zhì)。Ⅰ型酶：使一定部位的一條鏈切口-封口反應(yīng)Ⅱ型酶：DNA兩條鏈同時發(fā)生切口-封口反應(yīng)

Ⅱ型酶還可使DNA形成超螺旋解除超螺旋（三）與解除DNA高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子3.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）與解開的DNA單鏈結(jié)合后，兩條DNA鏈就不能形成雙螺旋；還可以防止核酸酶的降解；原核生物中SSB與DNA單鏈結(jié)合表現(xiàn)正協(xié)同效應(yīng)。（三）與解除DNA高級結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶與蛋白因子4.引發(fā)酶（primase）所有DNA聚合酶都只能在模板鏈的指令下，在引物（通常RNA）3’-OH添加新核苷酸功能，沒有從頭合成活力；引發(fā)酶合成一小段引物，作為DNA合成的引物；必須與幾種輔助蛋白組裝成引發(fā)體，才有合成引物的活性。二、DNA的復(fù)制1、半保留復(fù)制方式OldstrandNewstrandThehypothesisofsemiconservativereplicationproposedbyWatsonandCrickin1953.大腸桿菌培養(yǎng)在15N培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)到14N培養(yǎng)基中，經(jīng)過一代（50分鐘左右）第二代幾代后14N越來越多，雜種分子的量保持不變通過DNA復(fù)制形成的新DNA分子,與原來的DNA分子完全相同。經(jīng)過一個復(fù)制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復(fù)制。2.DNA半不連續(xù)復(fù)制至今發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶只能催化從模板的3′端向5′端前進(jìn)的反應(yīng)。岡崎（1968）等人的實驗：用噬菌體T4感染的大腸桿菌作為實驗材料，以3H標(biāo)記的胸苷合成DNA.短時間內(nèi)測定同位素的摻入情況。實驗結(jié)果：短時間（2S）標(biāo)記出現(xiàn)在分子質(zhì)量較小的片段，只有在標(biāo)記時間長（30S以上）才出現(xiàn)在分子質(zhì)量較大的片段。岡崎片段——DNA合成是不連續(xù)的，先合成一些DNA小片段，其大小約含1000-2000個核苷酸殘基，然后再通過

DNA連接酶將它連接起來。二、DNA的復(fù)制3、DNA的復(fù)制過程（1）合成起始

a.辨認(rèn)起始點

DNA復(fù)制有固定的起始點。大腸桿菌：OriC含245bp,有兩個區(qū)域起關(guān)鍵作用，4個9核苷酸重復(fù)序列；3個13核苷酸重復(fù)序列（富含AT）。二、DNA的復(fù)制b.模板DNA解除高級結(jié)構(gòu)

dnaA蛋白與起始點形成復(fù)合物，促進(jìn)其他dna蛋白也與起始點形成復(fù)合物。一旦雙螺旋解開成單鏈，SSB即結(jié)合單鏈。

TopoⅡ在打結(jié)處切一口，使結(jié)松開。二、DNA的復(fù)制c.RNA引物的形成由引發(fā)酶以單鏈DNA為模板，按5’

3’合成一低聚引物，引物的第一個核苷酸通常是pppA(2)鏈的延伸在RNA引物上，由DNA聚合酶Ⅲ催化，在引物3’-OH每摻入一個核苷酸，從底物dNTP切下一個焦磷酸。新鏈的合成按5’

到3’的方向進(jìn)行，這條鏈稱先導(dǎo)鏈；另一條先形成岡崎片段，進(jìn)行不連續(xù)復(fù)制，稱后隨鏈。二、DNA的復(fù)制

(3)合成終止

線性DNA——當(dāng)復(fù)制叉到分子末端，復(fù)制即終止。

環(huán)狀DNA——多數(shù)為定點、雙向、對稱、等速的方式進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制終點一般距離起點1800，兩個復(fù)制叉在此相遇，合成終止。1.DNA的損傷與突變

損傷可造成突變或致死突變（mutation）：指一種遺傳狀態(tài)，可以通過復(fù)制而遺傳的DNA結(jié)構(gòu)的任何永久性改變。攜帶突變基因的生物稱為突變體，未突變的稱為野生型。損傷原因物理（紫外（見下頁）、高能射線、電離輻射）化學(xué)（烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類似物）生物因素（堿基對置換、堿基的插入/缺失造成移碼）三、DNA的損傷與修復(fù)當(dāng)DNA受到大劑量紫外線（波長260nm附近）照射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。2.DNA損傷修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)光復(fù)活（photoreactivation）可見光（最有效波長400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動物除外）的光復(fù)活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專一的修復(fù)形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體。切除修復(fù)（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞的修復(fù)功能對于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。重組修復(fù)（recombinationrepair）又稱復(fù)制后修復(fù)（postreplicationrepair）受損傷的DNA在進(jìn)行復(fù)制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過分子間重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來補(bǔ)上母鏈的空缺，此過程即重復(fù)修復(fù)。并非完全校正。SOS修復(fù)指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，又稱傾錯性修復(fù)（Error-ProneRepair）。第二節(jié)RNA的生物合成中心法則生物的遺傳信息從DNA傳遞給

mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)

mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和表達(dá)。1958年Crick將生物

遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則?；蜣D(zhuǎn)錄是以DNA為模板合成與其堿基順序互補(bǔ)的mRNA的過程。DNA雙螺旋解開成為轉(zhuǎn)錄模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。DNA雙鏈中的一條鏈作為模板合成mRNA，而另一條鏈不用于合成mRNA——不對稱轉(zhuǎn)錄。一、催化RNA合成的酶1.大腸桿菌RNA聚合酶全酶=α2ββ’

σ核心酶=α2ββ’σ—識別DNA鏈上合成RNA的起始信號，開始合成RNA鏈時，必須有σ因子，一旦合成開始以后，σ因子釋放出來。β’—參與酶與底物的結(jié)合，以及與σ因子和核心酶的結(jié)合。β—參與σ因子和核心酶的結(jié)合，并參與RNA合成的引發(fā)、延伸。α—與模板的結(jié)合、酶的滑動以及堿基識別有關(guān)。2.真核細(xì)胞RNA聚合酶在DEAE-Sephadex柱上的洗脫次序稱為酶Ⅰ、II、Ⅲ，基于對鵝膏覃堿的敏感程度稱為酶A、B、C

二、轉(zhuǎn)錄的過程識別解鏈起始延伸終止1.起始位點的識別

σ識別正確的啟動位點，啟動子的結(jié)構(gòu)至少由三部分組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別的信號；-10序列是酶的緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）；第三部分是RNA合成的起始點。3’5’+1轉(zhuǎn)錄起始點AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列

Sextama框

－10序列Pribnow框2.轉(zhuǎn)錄起始加入的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的啟動子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷三磷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點，σ亞基就會被釋放脫離核心酶。-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈E3.鏈的延伸

以NTP為原料和能量,DNA模板鏈為模板，靠核心酶的催化，核苷酸間通過3′,5′-磷酸二酯鍵成核糖核酸鏈(RNA)4.轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止信號有兩種情況弱終止子：依賴ρ因子（終止因子，terminators）的終止

NusA蛋白識別DNA鏈上的終止信號，在ρ因子幫助終止。

強(qiáng)終止子：（1）在終止點之前具有一段富含G-C的回文區(qū)域。（2）富含G-C的區(qū)域之后是一連串的dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串U（連續(xù)6個）。三、RNA轉(zhuǎn)錄后加工1.rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

rRNA基因轉(zhuǎn)錄原初產(chǎn)物原核生物：30S

哺乳動物：45S5srRNA5.8srRNA28srRNA有關(guān)Pr核糖體大亞基18srRNA有關(guān)Pr核糖體小亞基成熟核糖體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)RNAaseThe18S,5.8S,and28SrRNAsineukaryoticcellsarederivedfromonepre-rRNAmolecule(theprocessingneedssmallnucleolarRNA-containingproteins).2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工原核生物①核酸內(nèi)切酶在tRNA分子兩端切斷②核酸外切酶在3’端進(jìn)行修剪③在tRNA3’端加-CCAOH④核苷的修飾—甲基化（供體：S-腺苷蛋氨酸）RNA核酸內(nèi)切酶識別的是加工部位的空間結(jié)構(gòu)RNaseP：切斷tRNA5’端—5’端成熟酶RNaseF：切斷tRNA靠近3’端RNaseD：從3’端逐個切去附加序列識別整個tRNA的結(jié)構(gòu)，是3’端成熟酶3.mRNA的加工與成熟原核生物mRNA合成的特點①多順反子轉(zhuǎn)錄—幾個結(jié)構(gòu)基因在一條mRNA鏈上②轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)—大多無需加工、直接翻譯③mRNA壽命較短真核生物mRNA合成的特點①單順反子轉(zhuǎn)錄②轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中—需加工才能翻譯③mRNA壽命較長④帽子和尾結(jié)構(gòu)多聚腺苷酸聚合酶催化加尾——加尾信號AAUAAA四、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式基因表達(dá)調(diào)控概述原核生物以操縱子為單元進(jìn)行表達(dá)和調(diào)控，特異的阻遏蛋白是控制原核啟動序列活性的重要因素。

乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制色氨酸操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制I－調(diào)節(jié)基因P－啟動子O－操作子（操作基因）Z、Y、A－三種結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)

當(dāng)無誘導(dǎo)物乳糖存在時，調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏蛋白（repressorprotein）處于活性狀態(tài)，阻止RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，則無法啟動轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘恰：笳咦鳛橐环N誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、轉(zhuǎn)錄發(fā)生。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應(yīng)用。

CAP（代謝產(chǎn)物活化蛋白）的正性調(diào)節(jié)

當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結(jié)合，這時CAP結(jié)合在lac啟動序列附近的CAP位點，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性。葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低了cAMP的濃度，CAP不能被活化形成CAP－cAMP復(fù)合物，則不能轉(zhuǎn)錄。lac阻遏蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)與CAP正性調(diào)節(jié)兩種機(jī)制協(xié)調(diào)合作：當(dāng)Lac阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；但是如果沒有CAP存在來加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，即使阻遏蛋白從操縱序列上解聚仍幾無轉(zhuǎn)錄活性。

lac操縱子強(qiáng)的誘導(dǎo)作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp阻遏蛋白原調(diào)節(jié)基因編碼的阻遏蛋白原不與操作基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。Trp或Trp－RNA與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)。阻遏物調(diào)節(jié)機(jī)制衰減子調(diào)節(jié)機(jī)制衰減子：在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的衰減作用，用于終止和減弱轉(zhuǎn)錄，這種調(diào)節(jié)的作用部位叫衰減子——是一種位于結(jié)構(gòu)基因上游前導(dǎo)區(qū)的終止子。1.生物遺傳信息傳遞的中心法則中不包括A.DNADNAB.DNARNAC.RNADNAD.RNARNAE.蛋白質(zhì)RNA2.生物遺傳信息傳遞的中心法則是A.以DNA為中心B.以RNA為中心C.以蛋白質(zhì)為中心D.以轉(zhuǎn)錄為中心E.以為復(fù)制中心3關(guān)于DNA合成的敘述，正確的是DNA的生物合成即半保留復(fù)制B.DNA的生物合成必須以DNA為模板C.DNA的生物合成必須以DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化D.DNA的生物合成是半不連續(xù)復(fù)制E.DNA的生物合成包括DNA的半保留復(fù)制、DNA修復(fù)合成和反轉(zhuǎn)錄4.真核細(xì)胞中DNA的復(fù)制是在哪個部位進(jìn)行的A.核蛋白體B.線粒體C.細(xì)胞核D.微粒體E.細(xì)胞漿5.關(guān)于DNA半不連續(xù)合成敘述，錯誤的是前導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的B.后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的C.后隨鏈的合成方向是3'5'，前導(dǎo)鏈?zhǔn)?'3‘D.不連續(xù)合成的片段是岡崎片段E.后隨鏈的合成滯后于前導(dǎo)鏈6.關(guān)于DNA復(fù)制的敘述，錯誤的是是半保留復(fù)制B.合成方向以5'3'C.以四種dNTP為原料D.是半不連續(xù)復(fù)制7.DNA復(fù)制的引物是A.以DNA為模板合成的DNA片段B.以RNA為模板合成的DNA片段C.以DNA的一個基因為模板合成的RNA片段D.以復(fù)制起始處DNA為模板合成的RNA短片段E.引物存在于復(fù)制完成的片段中8.大腸桿菌DNA聚合酶具有3‘5’核酸外切酶活性B.具有3'5'聚合酶活性C.不需引物D.可催化2個游離的dNTP以3'5'-磷酸二酯鍵相連E.需四種NTP為底物9.關(guān)于DNA復(fù)制的需要：①解鏈酶②引物酶③DNA聚合酶④拓?fù)洚悩?gòu)酶⑤連接酶作用順序為A.1，2，3，4，5B.4，1，2，3，5C.1，4，