GB/T 18935-2018口蹄疫診斷技術

ICS11220

B41.

中華人民共和國國家標準

GB/T18935—2018

代替

GB/T18935—2003

口蹄疫診斷技術

Diagnostictechniquesforfootandmouthdisease

2018-09-17發(fā)布2019-04-01實施

國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

GB/T18935—2018

目次

前言

…………………………Ⅴ

引言

…………………………Ⅵ

范圍

1………………………1

規(guī)范性引用文件

2…………………………1

縮略語

3……………………1

臨床診斷

4…………………1

易感動物

4.1……………1

臨床癥狀

4.2……………2

病理變化

4.3……………2

結(jié)果判定

4.4……………2

實驗室診斷樣品采集

5……………………2

器材

5.1…………………2

試劑

5.2…………………2

樣品采集

5.3……………2

樣品處理

5.4……………3

病毒分離

6…………………3

器材

6.1…………………3

試劑

6.2…………………4

試驗動物與細胞

6.3……………………4

試驗程序

6.4……………4

病毒鑒定

6.5……………5

結(jié)果判定

6.6……………5

定型酶聯(lián)免疫吸附試驗定型

7(ELISA)…………………5

器材

7.1…………………5

試劑

7.2…………………5

試驗程序

7.3……………6

試驗成立條件

7.4………………………6

結(jié)果判定

7.5……………6

多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應多重

8-(RT-PCR)…………6

器材

8.1…………………6

引物

8.2…………………7

試劑

8.3…………………7

樣品準備

8.4……………8

試驗程序

8.5……………8

試驗成立條件

8.6………………………9

結(jié)果判定

8.7……………9

Ⅰ

GB/T18935—2018

定型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應定型

9-(RT-PCR)…………9

器材

9.1…………………9

引物

9.2…………………9

試劑

9.3…………………9

樣品準備

9.4……………9

試驗程序

9.5……………9

試驗成立條件

9.6………………………10

結(jié)果判定

9.7……………10

病毒基因序列分析

10VP1………………10

器材

10.1………………10

引物

10.2………………10

試劑

10.3………………10

樣品準備

10.4…………………………10

試驗程序

10.5…………………………10

試驗成立條件

10.6……………………11

結(jié)果判定與分析

10.7…………………11

熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應熒光定量

11(RT-PCR)……………11

器材

11.1………………11

引物和探針

11.2………………………11

試劑

11.3………………11

樣品準備

11.4…………………………12

試驗程序

11.5…………………………12

試驗成立條件

11.6……………………12

結(jié)果判定

11.7…………………………12

病毒中和試驗

12(VN)…………………12

器材

12.1………………12

試劑

12.2………………12

試驗程序

12.3…………………………13

試驗成立條件

12.4……………………13

結(jié)果判定

12.5…………………………13

液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗

13(LPB-ELISA)…………14

器材

13.1………………14

試劑

13.2………………14

對照血清

13.3…………………………14

試驗程序

13.4…………………………14

試驗成立條件

13.5……………………14

結(jié)果判定

13.6…………………………14

固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗

14(SPC-ELISA)…………15

器材

14.1………………15

試劑

14.2………………15

試驗程序

14.3…………………………15

Ⅱ

GB/T18935—2018

試驗成立條件

14.4……………………15

結(jié)果判定

14.5…………………………15

非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗

153ABC(3ABC-I-ELISA)………………15

器材

15.1………………15

試劑

15.2………………16

試驗程序

15.3…………………………16

試驗成立條件

15.4……………………16

結(jié)果計算與判定

15.5…………………16

非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗

163ABC(3ABC-B-ELISA)………………16

器材

16.1………………16

試劑

16.2………………16

試驗程序

16.3…………………………17

試驗結(jié)果有效性判定

16.4……………17

結(jié)果判定

16.5…………………………17

綜合判定

17………………17

附錄規(guī)范性附錄樣品保存液和細胞培養(yǎng)液

A()………18

附錄規(guī)范性附錄酶聯(lián)免疫吸附試驗用溶液的配制

B()………………20

附錄規(guī)范性附錄核酸檢測用液體配制

C()……………22

Ⅲ

GB/T18935—2018

前言

本標準按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標準代替口蹄疫診斷技術本標準與相比除編輯性

GB/T18935—2003《》。GB/T18935—2003,

修改外主要技術變化如下

,:

增加了臨床診斷

———;

刪除了微量補體結(jié)合試驗

———;

取消了查毒試驗部分其相關內(nèi)容在其他部分規(guī)定

———,;

刪除了病毒感染相關抗原瓊脂凝膠免疫擴散試驗增加了非結(jié)構(gòu)蛋白

———(VIA)(VIA-AGID),

抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷酶聯(lián)免疫

3ABC(3ABC-I-ELISA)3ABC

吸附試驗以替代

(3ABC-B-ELISA)VIA-AGID;

增加了定型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

———-;

增加了病毒基因序列分析

———VP1;

增加了熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

———-。

本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出

。

本標準由全國動物衛(wèi)生標準化技術委員會歸口

(SAC/TC181)。

本標準起草單位中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所

:。

本標準主要起草人劉湘濤張強郭建宏何繼軍劉在新盧曾軍包慧芳?；菔|田宏鄭海學

:、、、、、、、、、、

尚佑軍馬軍武吳國華靳野林密馬維民盧永干朱彩珠

、、、、、、、。

本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為

:

———GB/T18935—2003。

Ⅴ

GB/T18935—2018

引言

口蹄疫是由口蹄疫病毒感

(Footandmouthdisease,FMD)(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)

染引起偶蹄動物的一種急性烈性接觸性傳染病口蹄疫可造成巨大經(jīng)濟損失和社會影響世界動物

、、。,

衛(wèi)生組織將口蹄疫列為必須報告的動物傳染病我國規(guī)定口蹄疫為一類動物疫病

(OIE),。

口蹄疫的傳染源主要為潛伏期感染及臨床發(fā)病動物易感動物可通過呼吸道消化道生殖道和傷

。、、

口感染病毒通常以直接或間接接觸飛沫等方式傳播或通過人或犬蠅蜱鳥等動物媒介或經(jīng)車

,(),、、、,

輛器具等被污染物傳播如果環(huán)境氣候適宜病毒可隨風遠距離傳播感染動物呼出物唾液糞便

、。,。、、、

尿液乳精液及肉和副產(chǎn)品均可帶毒牛羊等反芻動物感染后病毒可在食道咽喉部持續(xù)帶毒

、、。,-。

口蹄疫病毒在分類上屬小病毒科Picornaviridae口蹄疫病毒屬有個血清型即

RNA(),,7,O、A、

和型各血清型間無交叉免疫保護反應免疫防控時相當于面臨種不

Asia1、C、SAT1、SAT2SAT3,,7

同的疫病血清型鑒定是免疫防控首先要解決的問題適于口蹄疫診斷的樣品是未破裂或剛破裂的水

,。

泡皮和水泡液在不能獲得水泡皮和水泡液的情況下可采集血液和或用食道探杯采集反芻動物食

。,()

道咽部分泌物樣品這些樣品中也存在病毒未有組織樣品的情況下檢測特異性抗體也用于診斷

-,。,。

對組織或液體樣品進行病毒分離檢測是否存在口蹄疫病毒抗原或核酸可以作出陽性診斷如果樣品

,。

不足或檢測結(jié)果不確定可通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和或用敏感細胞培養(yǎng)或吮乳小白鼠

,(RT-PCR),()

對樣品中可能存在的核酸或活病毒進行增殖后再用酶聯(lián)免疫吸附試驗或進行檢測

(ELISA)RT-PCR。

血清學診斷中若未接種疫苗的動物體內(nèi)檢出特異性抗體即可作出陽性診斷這種方法對溫和型病例

,,,

和不易采到水泡性上皮樣品的病例十分有用檢測口蹄疫病毒的某些非結(jié)構(gòu)蛋白抗體可做為曾經(jīng)或目

。

前病毒感染的證據(jù)用于口蹄疫病毒型別鑒定的方法有定型酶聯(lián)免疫吸附試驗定型定型反

。(ELISA)、

轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應定型用于口蹄疫病毒抗原和核酸診斷的方法有多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶

-(RT-PCR),-

鏈式反應多重病毒基因序列分析和熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應熒光定量

(RT-PCR)、VP1-(RT-

用于口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測的方法有病毒中和試驗液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗

PCR),(VN)、

和固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗用于檢測口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體診斷

(LPB-ELISA)(SPC-ELISA),

的方法有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和非結(jié)構(gòu)蛋白

(NSP)3ABC(3ABC-I-ELISA)(NSP)

抗體阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗

3ABC(3ABC-B-ELISA)。

本標準的修訂參考了陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊版并結(jié)合我國相關技術研

OIE《》(2017),

究新成果制定在技術上與國際先進技術保持一致

,。

Ⅵ

GB/T18935—2018

口蹄疫診斷技術

1范圍

本標準規(guī)定了口蹄疫臨床診斷和實驗室診斷的技術要求

(Footandmouthdisease,FMD)。

本標準適用于豬牛羊等偶蹄動物及其他易感動物口蹄疫的診斷

、、。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的