內(nèi)容文稿教案

中西醫(yī)結(jié)合南方紅豆杉對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及EGFR等靶點(diǎn)研2010年浙江省中 A549肺癌及對EGFR等靶點(diǎn)的 項(xiàng)目編號 一．立論依據(jù)（包括課題理由、研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析和主要參考文獻(xiàn)性支氣管肺癌是目前世界上最常見的之一，率早中居于前列。時(shí)，80%患者已失去手術(shù)根治可能，90%須接受化療。但是，化療對腫瘤細(xì)胞易對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物毒副反應(yīng)發(fā)生且療效有限。非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallcelllungCancer）510%，小細(xì)胞肺癌（SmallcelllungCancer）3%，療效很不理想。多年來，科研人病理研究是最為熱點(diǎn)的領(lǐng)域[1]。分子靶向是靶向治療中特異性最它針對的是可能導(dǎo)變的各個(gè)環(huán)receptor，EGFR（1）（2）receptorEGFRkinaseTK域。其胞內(nèi)區(qū)域與erbB癌產(chǎn)物高度同源，胞外配體結(jié)合EGFR后引起EGFR構(gòu)型改變，導(dǎo)致EGFR同二聚體或其他相關(guān)受體異聚化而活化它們的胞漿位點(diǎn)[4,5]EGFR（EGFEGFEGFRHER-2EGFR形成同源二聚體，而有著HER2異二聚體的功能較強(qiáng)。受體的二聚體化激活受體的膜內(nèi)酪氨酸激酶，使其自身磷酸化，磷酸化的酪氨SH2PTB區(qū)的胞內(nèi)信號分子（PLC-γ，grb2、Cbl等）結(jié)合后，將主要由有絲（3（3K/Akt-T通路把信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)使轉(zhuǎn)錄增加促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化[6]因此其作為治療靶點(diǎn)早已有提出并日益受到人們關(guān)注其中針對肺癌EGR酪氨酸激酶的易瑞Iessa和特羅（arcev也先后上市療效確切。但其價(jià)格讓患者及其家屬重負(fù)，受用者了了。Brambilla-E研究認(rèn)為[8]，肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多、多步驟過程的結(jié)果，在惡變前狀態(tài)，bal-2/bax比例失衡有助于細(xì)胞擴(kuò)增。因?yàn)閷?xì)胞的易感性受控于胞質(zhì)內(nèi)bcl-2成分諸如bal-2和bax間的平衡，bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所以其被看作抑癌Bax低表達(dá)有利于癌細(xì)胞存活，bcl-2高表達(dá)有利于癌細(xì)胞的擴(kuò)增癌旁組織早期中bcl-2和bax的比例常有改變。兩者比例能決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其比例高，則易發(fā)展為癌。抑制凋 過表達(dá)促凋亡bax低表達(dá)，可使細(xì)胞凋亡抑制，細(xì)胞存活期延長擴(kuò)增，這是肺癌發(fā)生的重要機(jī)制之一[9]。環(huán)氧化酶（cyclooxygenase,COX-2）是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗睾脱ㄋ氐南匏倜福c機(jī)體的各種生理病理過程密切相關(guān)，有兩種同工酶：COX-1、COX-2COX-1COX-2的結(jié)構(gòu)相似，但在組織中的分布和功能都不盡相同。COX-2NSCLCNSCLC預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)紅豆杉中有40多種有效成分，其中主要有：紫杉醇、紅豆杉多糖、巴卡亭Ⅲ、生物堿、紫衫黃酮、萜類、小分子類物質(zhì)（鞣質(zhì)）等。紅豆杉細(xì)胞提取物可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和Hep-2發(fā)生凋亡，抑制腫瘤 1、2、腫瘤壞死因子，干擾素等細(xì)胞因子的合成；激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞， 研究員曾于2006年5月20SD660180天，大鼠各項(xiàng)生理者歡迎。但迄今為止，尚無南方紅豆杉靶向治療抑制腫瘤機(jī)理研究。若能從分子水平加以闡述，揭昂貴的靶向治療西藥費(fèi)用，減輕患者及其家屬沉重負(fù)擔(dān)，而且對中的發(fā)掘、整理、提高及世界有重 [2]．韓寶惠主編.腫瘤生物免疫靶向治療 科學(xué)技 ，魏金星，等.腎細(xì)胞癌中血管密度與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外 [4]．PaoW,MillerVA.Epidermalgrowthfactorreceptormutations,small-moleculekinaseinhibitors,andnon-small-celllungcancer:currentknowledgeandfuturedirections[J].JClinOncol,2005,23(11):2556-[5]．WangChengxin,CaoYA.AtumortheapytargetingEGFRandit`smutation[J].JournalofInternationalPathologyandClinicalMedicine,2000,20(2):137-140. 2004,31（1：26-[7]．，梁婷婷，宋文哲.Survivin在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)，2004,39（5：22-[8]．Brambilla-E,Gazzeri-S,Lantuejoul-S,etal.p53mutantimmunophenotypeandderegulationofp53transcriptionpathway(bcl-2,bax,andwafl)inprecursorbronchiallesionoflingcancer.Clin-cancer-Res,1998,4(7):1609-[9]．Zhang-H,Yousem-SA,Franklin-WA,etal.Differetiationandprogrammedcelldeath-relatedintermediatebiomarkersforthedevelopmentofnon-smallcelllungcancer:apilotstudy.Hum-Pathol,1998,29(9):965-[10]．ReddyBS,RaoCV,SeibertK.Evaluationofcyclooxygenase-2inhibitorforpotentialchemopreventivepropertiesincoloncarcinogenesis[J].CancerRes,1996,56(3):4566-4569.[11]．SweeneyCJ.Whycycooxygenase-2inhibitorpluschemotherapy[J].AmJClinOnocol(CCT),2003,26(4):[12]．MeertAP,MartinB,DelmotteP,etal,TheroleofEGFR-Rexpressiononpatientsurvivalinlungcancer,asystematicreviewwithmeta-ysis[J].EurRespirJ,2002,20(4):975-998.[13]．，梅興國，龔偉等.SMMC-7721HEp22的作用研究，中國藥2003,19（7：801-[14]．本樣主編.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)[M].第一版.：科學(xué)技術(shù)，1999,1449-二通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察南方紅豆杉對人肺癌A549細(xì)胞生長的影響，并探討其如何對人肺癌A549細(xì)胞A549A549細(xì)胞株增殖的，EGFR總蛋白和蛋白磷酸化表達(dá)（Western-Bloting技術(shù)）變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2（ELISA法）A549細(xì)胞株增殖的主要靶點(diǎn)，為進(jìn)一步開展相應(yīng)信號傳 對于3種方法對于上述 分為中劑量特羅凱3.5mg/kg/d組，標(biāo)準(zhǔn)劑量特羅凱7mg/kg/d組，低劑量紅豆杉186.65mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d組，高劑量紅豆杉746.6mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d+中劑量特羅凱3.5mg/kg/d時(shí)后，清醒狀態(tài)下無菌心臟采血，分離，同組兔混合，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。組，10%中劑量特羅凱組，10%標(biāo)準(zhǔn)劑量特羅凱組，10%低劑量紅豆杉組，10%中劑量紅豆杉組，10%624、488A549細(xì)胞株增殖的影響（MTT法EGFR、Survivin、bcl-2、bax、）變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平檢測（ELISA法）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的各項(xiàng)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢x2檢驗(yàn)、直線相關(guān)與回歸等。 A549 組

中 標(biāo)劑 準(zhǔn)量 劑特 量羅 特++凱 羅++ 組（MTT（MTT法ELISA技術(shù)測定2的表達(dá)RT-PCR技術(shù)測 、COX-2mRNA的表達(dá)技術(shù)測定COX-2bax總蛋南方紅豆杉由寧波泰康紅豆杉生物工 制成顆粒劑，8克/包，于正規(guī)途徑購得細(xì)胞系：人肺癌A549細(xì)胞株引 細(xì)胞生 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：購自浙江 大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心含藥的：選擇純種新西蘭家兔162kg8組，根據(jù)人和動(dòng)物體表面積折算的3.5mg/kg/d7mg/kg/d186.65mg/kg/d特羅凱3.5mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d+標(biāo)準(zhǔn)劑量特羅凱7mg/kg/d組，及對照組。連續(xù)灌胃31小時(shí)后，清醒狀態(tài)下無菌心臟采血，分離，同組兔混合，過濾除菌，-20℃保存南方紅豆杉對人肺癌A549細(xì)胞生長的影響：取對數(shù)期A549細(xì)胞，接種于96孔板，分別設(shè)10%鹽水血清組，10%中劑量特羅凱組，10%標(biāo)準(zhǔn)劑量特羅凱組，10%低劑量紅豆杉組，10%中劑量紅豆杉組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48小時(shí)后終止實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖活性，收集上清液和細(xì)胞EGFR變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平檢測（ELISA法）SPSSt檢A549細(xì)胞，得到通過體內(nèi)代謝的實(shí)驗(yàn)，觀察南方紅豆杉對肺癌A549細(xì)胞生長的影響，并探討如何對人肺癌A549細(xì)胞EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及總蛋白的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，揭示南方紅豆杉抗肺癌A549細(xì)胞通過南方紅豆杉抗人肺癌A549細(xì)胞生長機(jī)理及靶點(diǎn)的研究，探討其安全、有效的劑量，開拓中藥分子 于浙江中大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心兔 于浙江省中醫(yī)院中心探索南方紅豆杉含藥抑制肺癌A549細(xì)胞生長的作用 測定EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及總蛋白的表達(dá)明確含藥不同濃度的南方紅豆杉對肺癌A549細(xì)胞株有一定的抑制作用及主要作用靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部