對羥基苯甲酸酯的分析

對羥基苯甲酸酯的分析第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日2023/2/31一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)高效液相色譜儀器的基本使用方法。理解和掌握高效液相色譜分離分析基本原理。學(xué)會用外標(biāo)法和校正歸一化法進(jìn)行色譜定量分析。2第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日二、HPLC簡介1967年，高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)正式問世。

高壓：流動相為液體，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓，300～600×105Pa。高速：分析速度快、通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)10-9g／mL，熒光檢測器可達(dá)

10-11g／mL

。第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日HPLC應(yīng)用廣泛由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性，特適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過HPLC來完成的。各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象4第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日液相色譜（HPLC）氣相色譜（GC）相同點(diǎn)色譜柱可反復(fù)使用，分離效能高，高靈敏度，進(jìn)樣量小，分析速度快，使用范圍廣分析對象高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物、離子型樣品氣體、沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的化合物流動相不同極性的液體（有一定親和作用）惰性氣體（無親和性，只起運(yùn)載作用）溫度一般室溫較高檢測器紫外吸收檢測器（光電二極管陣列檢測器），熒光檢測器，電化學(xué)檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器，質(zhì)譜檢測器，示差折光檢測器氫火焰離子化檢測器（FID），熱導(dǎo)檢測器（TCD)，氮磷檢測器（NPD），火焰光度檢測器（FPD），電子捕獲檢測器（ECD)等類HPLC與GC的比較5第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日Agilent1100儀器結(jié)構(gòu)圖手執(zhí)控制器檢測器柱溫箱自動進(jìn)樣器泵脫氣機(jī)溶劑柜三、Agilent-1100液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)：單元、雙元、

四元泵進(jìn)樣系統(tǒng)：手動、自動分離系統(tǒng)：C18、C8色譜柱檢測系統(tǒng)：檢測器第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日1、高壓輸液系統(tǒng)儲液器：0.5L～2L的玻璃瓶（白色、棕色）。脫氣裝置：將氣體從溶劑中除去，離線脫氣和在線真空脫氣。高壓輸液泵：恒壓泵、恒流泵恒流泵使用最廣泛，有單活塞和雙活塞往復(fù)泵。流量準(zhǔn)確、可調(diào)，流速為0.5～2mL/min，泵最大流量范圍為5～10mL/min（排氣泡）。7第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日流動相HPLC級溶劑水為超純水過濾(最大0.45μm,0.2μm最好)脫氣，尤其在低流速時相溶第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日液相色譜手動進(jìn)樣器2、進(jìn)樣系統(tǒng)9第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日準(zhǔn)備時，流動相直接進(jìn)柱，進(jìn)樣口1與定量管連接，樣品充滿定量管后，多余樣品從2流出。進(jìn)樣時，泵將流動相壓入定量管，將樣品全部攜帶進(jìn)入色譜柱分析。10第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日注射器氣相色譜注射器的針頭為尖，液相色譜的注射器針頭為平，兩者不能混用。11第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長１0～30cm，固定相粒徑5～10μm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱3、色譜柱第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日反相柱------固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日正相柱------固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2）和氰基團(tuán)（CN）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。14第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日手性色譜柱-------是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相，來實(shí)現(xiàn)外消旋物的廣泛分離。特點(diǎn)：具有專一性、通用性不廣。價格較貴。第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日

紫外吸收檢測器（UltravioletVisibleDetector，UVD）目前在HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器。包括：

可變波長紫外檢測器（VWD）

二極管陣列檢測器（DAD）熒光檢測器（FluorescenceDetector，F(xiàn)D）示差折光檢測器（RefractiveIndexDetector，RID）4、液相色譜檢測器第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日TheGoodUser下列優(yōu)良/常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作能夠延長儀器壽命：流動相和樣品進(jìn)行過濾。保證溶劑的相溶性。儀器使用完畢，沖洗整個系統(tǒng)，去掉鹽份，防止污染。對儀器進(jìn)行定期維護(hù)和保養(yǎng)。定期使用甲醇或異丙醇沖洗系統(tǒng)。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日色譜過程：在有互不相溶的兩相——流動相和固定相的體系中，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時，第三組分（即溶質(zhì)或吸附質(zhì)）連續(xù)不斷地在兩相之間進(jìn)行分配的過程。由于流動相、固定相以及溶質(zhì)混合物性質(zhì)的不同，在色譜過程中溶質(zhì)混合物中的各組分表現(xiàn)出不同的色譜行為，從而使各組分彼此相互分離。四、基本分離原理18第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日色譜分析法的實(shí)質(zhì)：不同溶質(zhì)分子因結(jié)構(gòu)不同而與流動相及固定相的相互作用力不同，從而引起在色譜柱內(nèi)運(yùn)行過程中作用機(jī)理的差異。經(jīng)過柱內(nèi)多次作用的疊加后在宏觀上引起其在柱內(nèi)停留時間（保留時間）的差異，形成事實(shí)上的分離。基本分離原理19第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日主要色譜類型分配色譜：液液分配色譜（Liquid-liquidpartitionchromatography）

化學(xué)鍵合相色譜（Chemicallyboundedphasechromatography,CBPC）反相離子對色譜液-固吸附色譜（Liquid-solidadsorptionchromatography,LSAC）離子交換色譜（Ion-exchangechromatography）空間排阻色譜（Size-exclusionchromatography）親和色譜法（Affinitychromatography）第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日分配色譜

反相分配色譜：流動相極性＞固定相極性正相分配色譜：流動相極性＜固定相極性反相：固定相：C18,C8流動相：水，甲醇，乙腈等極性溶劑的混合溶劑適合極性小的芳香族化合物正相：固定相：-CN,-NH2流動相：烷烴，異丙醇，四氫呋喃等的混合溶劑適合于極性差異大的化合物第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日22第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日液相色譜流動相23第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日液相色譜分析中，在紫外區(qū)有明顯吸收，可以利用紫外檢測器進(jìn)行檢測，其工作原理是Lambert-Beer定律。五、基本檢測原理24第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日定性定量分析的原理用標(biāo)準(zhǔn)物比對法定性：特定組分在同色譜條件下有不變的保留值(時間、體積等)，可將之與已知純物質(zhì)的相應(yīng)保留值作比對的方法進(jìn)行定性分析。三聚氰胺三聚氰酸豬肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析25第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日用外標(biāo)法定量：以不同量標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)樣得到峰面積，然后作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，得到相關(guān)系數(shù)。然后進(jìn)樣得到被測試樣的峰面積從曲線中查到含量。方法適用于樣品復(fù)雜，但只對部分組分感興趣時。定性定量分析的原理26第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日校正歸一化法定量：因不同組分的紫外吸收情況不同，等量樣品的吸光度值不相等。因而需要采用校正歸一化法定量:方法適用于樣品不很復(fù)雜，且部分組分都能流出色譜柱并在檢測器上有響應(yīng)時。定性定量分析的原理27第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日Agilent-1100液相色譜儀：四元高壓泵C18色譜柱手動進(jìn)樣器可變波長紫外檢測器色譜工作站六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容28第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟——I打開計算機(jī)啟動“bootp”文件，然后打開儀器電源建立計算機(jī)和儀器的連接。啟動工作站（online），調(diào)整好流動相流量和檢測波長，等待基線平直。前期準(zhǔn)備29第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟——II在甲醇:水=80:20、70:30、65:35的不同配比流動相中分別取未知試樣25μL進(jìn)樣分析，記錄保留時間和各組分間的分離度，以分離度大于1.5且保留時間最短為原則選定最佳流動相配比。注意：每次更換流動相都需等待5min左右以平衡色譜系統(tǒng)。條件試驗(yàn)I—流動相配比30第三十頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟——III

在最佳流動相配比條件下，以0.8、1.0、1.2mL/min不同的流動相流速下取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25μL進(jìn)樣分析，以同樣原則選定最佳流動相流速。問題I：每次更換流動相還需等待5min嗎？問題II：可以利用本步驟實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量校正因子的確認(rèn)嗎？條件試驗(yàn)II—流動相流速31第三十一頁，共三十三頁