實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)第一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理Chromo4介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)程序的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理Chromo4介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)程序的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用第三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)簡(jiǎn)介PCR:polymerasechainreaction多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文詞首字母的縮寫(xiě)，是一種體外選擇性擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依據(jù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制特性，用人工合成的小片段第四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)簡(jiǎn)介寡核甘酸引物與經(jīng)高溫（變性溫度）變性形成的單鏈DNA模板，在特定溫度（復(fù)性溫度）下產(chǎn)生序列特異性互補(bǔ)結(jié)合，在適當(dāng)溫度（延伸溫度）條件下，由DNA多聚酶催化使已經(jīng)結(jié)合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸產(chǎn)生與模板序列第五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日常規(guī)PCR完全互補(bǔ)的新的DNA單鏈。PCR技術(shù)自1985年由美國(guó)PE公司的Mullis等發(fā)明并推出市場(chǎng)應(yīng)用以來(lái)，實(shí)現(xiàn)了小片段DNA的體外快速擴(kuò)增，為各種因DNA序列的變異、缺失以及由此導(dǎo)致的遺傳缺陷和相關(guān)疾病的研究和臨床診斷提供了強(qiáng)有第六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日常規(guī)PCR力的手段，為各種病原體包括微生物、細(xì)菌、病毒等所致疾病的快速確診提供了技術(shù)條件，極大地促進(jìn)和加速了整個(gè)生命科學(xué)研究的進(jìn)程。第七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日常規(guī)PCR的定量在PCR反應(yīng)中，理論上擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始樣本中模板的含量成正比。但受多種因素的影響，其精確定量模板的可信度明顯不足。為克服上述不足，人們?cè)O(shè)計(jì)出包括內(nèi)標(biāo)、競(jìng)爭(zhēng)、酶聯(lián)、尿苷酶降解等多種定量方法。第八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)標(biāo)法在不同的PCR反應(yīng)管中加入已知量的內(nèi)標(biāo)模板和引物，內(nèi)標(biāo)模板可由基因工程合成或采用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品。在樣品模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)模板也被擴(kuò)增。二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)電泳或其它方法分離，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照進(jìn)行樣本模板定量。第九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)爭(zhēng)法將含有一個(gè)新內(nèi)切酶位點(diǎn)的外源性模板加入PCR反應(yīng)管中，待測(cè)樣品模板與外源性模板用同一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)內(nèi)切酶消化競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物成為兩個(gè)片段，通過(guò)電泳等分離檢測(cè)，根據(jù)已知模板的量推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。第十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固定在固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，檢測(cè)酶底物顯色情況，通過(guò)內(nèi)標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的目的。第十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日參照物在PCR定量中的作用作為擴(kuò)增系統(tǒng)的陽(yáng)性對(duì)照；作為未知樣本定量的參比標(biāo)準(zhǔn)；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性作為矯正擴(kuò)增系統(tǒng)內(nèi)部的擴(kuò)增效率，使其具有可比性。（參照物按其性質(zhì)不同可分為內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)）第十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)標(biāo)基因的選擇原則：內(nèi)標(biāo)基因在不同組織或者處理前后表達(dá)量不變內(nèi)標(biāo)基因的選擇一般選取GAPDH、β-actin等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3－磷酸甘油醛脫氫酶)第十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日傳統(tǒng)PCR定量方法的特點(diǎn)和不足1.定量的準(zhǔn)確度：傳統(tǒng)PCR定量方法的共同特點(diǎn)是針對(duì)PCR擴(kuò)增的最終產(chǎn)物進(jìn)行分析。因受酶活性、擴(kuò)增效率、尤其是平臺(tái)效應(yīng)等諸多因素的影響，檢測(cè)重現(xiàn)性極差，無(wú)法直接從終產(chǎn)物量推算出起始模板的精確含量。第十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日傳統(tǒng)PCR定量方法的特點(diǎn)和不足2.假陽(yáng)性污染：傳統(tǒng)PCR定量方法均依賴(lài)于各種不同類(lèi)型的PCR后處理過(guò)程，這些過(guò)程極易使數(shù)量巨大的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物飛散到實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境中，造成待檢樣本的污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的上升。第十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在PCR反應(yīng)體系中引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對(duì)每一循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物DNA片段的累積情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)記錄，通過(guò)數(shù)學(xué)模型實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性的分析。其特點(diǎn)為全封閉（污染少）、高精確、高靈敏。第十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR：

通過(guò)電泳、酶聯(lián)等后處理技術(shù)，對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終末產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：通過(guò)引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。三個(gè)關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)，熒光，定量第十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日PCRRealtimePCRS1S2M實(shí)時(shí)熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別第十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體）的發(fā)射光譜與另一基團(tuán)（受體）的激發(fā)光譜有一定的重疊，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)之間的距離足夠近（小于100?）時(shí)，以供體基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，可獲得由受體基團(tuán)發(fā)射的熒光。第十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日熒光共振能量轉(zhuǎn)移即：在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量直接轉(zhuǎn)移給了受體。在此過(guò)程中沒(méi)有光子的參與，是非輻射性的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，轉(zhuǎn)移效率與供－受體兩個(gè)基團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成正比例。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日FRET產(chǎn)生條件1.存在熒光供體和受體，而且供體的發(fā)色光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊常用的FRET組合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

第二十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

2供體和受體的距 離足夠近：1-10nm

（1－10nm為分子內(nèi)/ 間互作的距離：如蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、酶催 化反應(yīng)等。）

——超顯微觀察

3合適偶極方向

4足夠熒光壽命 無(wú)FRETFRETFRET產(chǎn)生條件第二十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日熒光域值線（fluorescencethresholdline）：背景熒光與熒光信號(hào)的分界值，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或經(jīng)驗(yàn)來(lái)設(shè)定，常設(shè)定為初始3-7個(gè)循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，各反應(yīng)管的熒光信號(hào)與熒光域值線的交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)（指數(shù)擴(kuò)增的開(kāi)始階段）。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可對(duì)樣本中目標(biāo)基因的含量進(jìn)行精確計(jì)算。初始模板濃度的確定第二十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies第二十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日用Ct值定量的意義實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開(kāi)始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。第二十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性

第二十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日絕對(duì)定量成為可能靈敏度高可檢測(cè)10–100個(gè)細(xì)胞中１個(gè)拷貝數(shù)量的基因低拷貝基因的檢測(cè)細(xì)小倍數(shù)差異樣品的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)第二十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日線性范圍寬(6-9個(gè)數(shù)量級(jí))

，無(wú)需稀釋高濃度樣品可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)定量高表達(dá)和低表達(dá)基因熒光探針使PCR產(chǎn)物檢測(cè)特異性進(jìn)一步提高全封閉無(wú)PCR后處理*幾乎沒(méi)有污染機(jī)會(huì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)第三十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

相對(duì)定量和絕對(duì)定量：相對(duì)定量指的是確定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本中靶序列量的變化值，絕對(duì)定量指的是確定樣本中靶序列的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法第三十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日相對(duì)定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較Ct值法絕對(duì)定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法第三十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對(duì)量是未知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)稀釋制成曲線，用以計(jì)算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比值。相對(duì)定量方法第三十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日比較Ct法:運(yùn)用數(shù)學(xué)公式計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來(lái)計(jì)算起始模板的量。前提：靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致。相對(duì)定量方法第三十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對(duì)量是已知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)稀釋制成曲線，用以計(jì)算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列的絕對(duì)含量。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常用作絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)?yè)Q算成其拷貝數(shù)。絕對(duì)定量方法第三十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日DNA結(jié)合染色：SYBRGreen1水解探針：TaqManMolecularBeacons熒光標(biāo)記引物雜交探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的熒光化學(xué)方法第三十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreen1TaqMan

MolecularBeacons熒光化學(xué)試劑第三十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenISYBRGreen1第三十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第三十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理第四十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理第四十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日熒光強(qiáng)度Vs溫度熒光強(qiáng)度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI重新游離到溶液中Tm是熔解曲線的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲線分析第四十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日以熒光值隨溫度變化作負(fù)導(dǎo)-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲線分析第四十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)化的讀板溫度

-高于非特異產(chǎn)物的Tm值

-低于目標(biāo)產(chǎn)物的Tm值A(chǔ)mpliconNon-specificproducts熔解曲線分析的應(yīng)用第四十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日不同讀板溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：80℃第四十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日不同讀板溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：86℃第四十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)反應(yīng)體系的組成：傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系+SYBRGreenI1.SG濃度：終濃度1:5,000－1:100,000，一般為1:10,000—1:70,000第四十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

2.Primer濃度：設(shè)計(jì)原則同普通PCR

終濃度50nM－300nM

固定摸板濃度的梯度實(shí)驗(yàn)不加摸板的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（NTC）

——有無(wú)非特異信號(hào)SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第四十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

熔解曲線的分析——是否單峰

建議使用HPLC純化的引物3.MgCl2濃度

降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物

最低可至1.5nM同時(shí)做梯度實(shí)驗(yàn)和NTC對(duì)照SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第四十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

4.反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)：

反應(yīng)溫度參考所用酶的種類(lèi)；

退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化；反應(yīng)時(shí)間與常規(guī)PCR類(lèi)似；擴(kuò)增片斷一般為200－300bp。SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第五十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

SYBRGreenI的特點(diǎn)和不足不涉及特異的探針，方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，特異性差；熒光強(qiáng)度依賴(lài)于體系中所有的dsDNA分子，不能區(qū)分引物二聚體、非特異性擴(kuò)增片斷等；通過(guò)繪制溶解曲線可較好地保證特異性。

第五十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第五十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)第五十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第五十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Taqman探針?lè)磻?yīng)體系的設(shè)計(jì)引物、探針設(shè)計(jì)原則：優(yōu)先選擇探針的序列；Tm值應(yīng)比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)30堿基，18-30bp,optimal20

；5’端不應(yīng)是G，G有可能會(huì)淬滅熒光素。

第五十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Taqman探針?lè)磻?yīng)體系的設(shè)計(jì)選擇合適的模板鏈，使探針的Cs>Gs；擴(kuò)增片斷不超過(guò)400bp，通常為80－150bp。避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)，特別是四個(gè)或四個(gè)以上Gs連續(xù)出現(xiàn)；引物應(yīng)盡量靠近探針；引物的Tm值為59－60度，長(zhǎng)度約20堿基；避免引物、探針之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第五十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日引物、探針濃度的優(yōu)化

目標(biāo)：最高的信號(hào)/背景比，最小的Ct值

引物濃度：50nM－900nM

探針濃度：50nM－250nM

通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定各自的濃度和比例Taqman探針?lè)磻?yīng)體系的設(shè)計(jì)第五十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Taqman探針的不足采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記，淬滅難以徹底，本底較高；采用酶外切活性，受酶性能影響；探針標(biāo)記成本較高。改進(jìn)：用不發(fā)光的淬滅熒光分子取代TAMRA第五十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Molecular

BeaconsMolecularBeacons發(fā)夾型雜交探針第五十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖熒光素淬滅劑環(huán)第六十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

第六十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons特點(diǎn)和不足對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性；是用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一；采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低；不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差；探針合成標(biāo)記較復(fù)雜。第六十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站

1．引物/探針的設(shè)計(jì)

?

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

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GeneFisher(BielefeldUniversity)

?

第六十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

1．引物/探針的設(shè)計(jì)

?

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

?

PerlPrimer(OwenMarshall)

?

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第六十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日．2.反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR引物設(shè)計(jì)

?

ExonPrimer(TechnischeUniversit?t,München)

?

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

3.引物特異性的驗(yàn)證

?

Blast(NCBI)引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第六十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日4．引物/探針特性的評(píng)估

?

OligoAnalyzer(IDT)

?

OligoAnalysis&PlottingTool(Operon/Qiagen)

?

NetPrimer(PremierBiosoft)

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第六十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日

?

GeneWalker(Cybergene)

?

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

?

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第六十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日5．?dāng)U增子二級(jí)結(jié)構(gòu)的評(píng)估

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第六十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用Chromo4介紹第六十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測(cè)；腫瘤研究；基因表達(dá)研究；免疫組份分析；基因突變及多態(tài)性的研究第七十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測(cè)：檢測(cè)患者血清中肝炎病毒濃度為臨床藥物治療和療效觀察提供依據(jù)；檢測(cè)HIV的量預(yù)測(cè)發(fā)病時(shí)間；選擇治療藥物：干擾素對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，對(duì)低拷貝者敏感。第七十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

腫瘤研究：癌基因及其相關(guān)基因的定量檢測(cè)可進(jìn)行腫瘤的早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷；檢測(cè)治療中和治療后微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，作為治療效果和估計(jì)復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性的依據(jù)。第七十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日基因差異表達(dá)研究標(biāo)準(zhǔn)曲線法

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定基因表達(dá)上的差異相對(duì)定量法(2－△△Ct法)

不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接分析得到基因差異表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系第七十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟：1.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測(cè)出目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比較不同樣品間目標(biāo)基因表達(dá)差異第七十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日相對(duì)定量法前提目標(biāo)基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，且接近100％。步驟通過(guò)實(shí)時(shí)熒光曲線得到目標(biāo)基因和看家基因的Ct值均一化校準(zhǔn)△Ct=Ct目標(biāo)基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同時(shí)間、不同組織)基因差異表達(dá)的倍數(shù)＝2－△△Ct第七十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日基因突變及多態(tài)性-SNP檢測(cè)第七十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日基因分型方法

使用TaqMan探針

(雙色法)溶解曲線

(單色法)序列特異PCR

(單色法)第七十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探針進(jìn)行基因型分析SNP檢測(cè)-基因型分析第七十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第七十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日從病人血液樣品中提取DNA基因型分類(lèi)：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Allele1controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十一頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日Allele2controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十二頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日HeterozygotecontrolFAMVIC多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十三頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十四頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI進(jìn)行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配會(huì)導(dǎo)致PCR效率上有大約1000倍的差異，由此導(dǎo)致產(chǎn)物積累會(huì)有10個(gè)cycles延遲

末端匹配與否，與反應(yīng)終產(chǎn)物量的多少?zèng)]有必然聯(lián)系

PCR#1PCR#2第八十五頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI進(jìn)行SNP分析MatchMismatch第八十六頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI進(jìn)行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile第八十七頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI進(jìn)行基因分型Intensity-dI/dT第八十八頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan?MicroRNA分析方法

加長(zhǎng)靶基因的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR第八十九頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日miRNAs的研究

MicroRNAs是一種內(nèi)源性長(zhǎng)度在２２個(gè)堿基左右的RNA分子，它在動(dòng)植物中具有重要的基因調(diào)控作用，它們通過(guò)與mRNAs結(jié)合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各種生命體中發(fā)現(xiàn)的miRNAs類(lèi)型共有約700種以上,通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件推測(cè)其中人源的約有２００種高豐度存在：平均每個(gè)細(xì)胞中約有50,000個(gè)拷貝第九十頁(yè)，共一百零二頁(yè)，2022年，8月28日為什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一類(lèi)新的基因調(diào)控因子某些miRNAs控制了動(dòng)植物的發(fā)育理解miRNA的功能將幫助現(xiàn)在流行的siRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果：RNA干擾／基因沉默MicroRNAs有可能成為新型的疾病標(biāo)志物MicroRNAs可能具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值第九十一頁(yè)，共一百零二