實時熒光定量技術(shù)

實時熒光定量技術(shù)第一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容實時熒光定量PCR的基本原理Chromo4介紹實時熒光定量PCR實驗程序的建立實時熒光定量PCR的應(yīng)用第二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容實時熒光定量PCR的基本原理Chromo4介紹實時熒光定量PCR實驗程序的建立實時熒光定量PCR的應(yīng)用第三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)簡介PCR:polymerasechainreaction多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文詞首字母的縮寫，是一種體外選擇性擴增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依據(jù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制特性，用人工合成的小片段第四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)簡介寡核甘酸引物與經(jīng)高溫（變性溫度）變性形成的單鏈DNA模板，在特定溫度（復(fù)性溫度）下產(chǎn)生序列特異性互補結(jié)合，在適當(dāng)溫度（延伸溫度）條件下，由DNA多聚酶催化使已經(jīng)結(jié)合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸產(chǎn)生與模板序列第五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日常規(guī)PCR完全互補的新的DNA單鏈。PCR技術(shù)自1985年由美國PE公司的Mullis等發(fā)明并推出市場應(yīng)用以來，實現(xiàn)了小片段DNA的體外快速擴增，為各種因DNA序列的變異、缺失以及由此導(dǎo)致的遺傳缺陷和相關(guān)疾病的研究和臨床診斷提供了強有第六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日常規(guī)PCR力的手段，為各種病原體包括微生物、細菌、病毒等所致疾病的快速確診提供了技術(shù)條件，極大地促進和加速了整個生命科學(xué)研究的進程。第七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日常規(guī)PCR的定量在PCR反應(yīng)中，理論上擴增產(chǎn)物的量與起始樣本中模板的含量成正比。但受多種因素的影響，其精確定量模板的可信度明顯不足。為克服上述不足，人們設(shè)計出包括內(nèi)標(biāo)、競爭、酶聯(lián)、尿苷酶降解等多種定量方法。第八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日內(nèi)標(biāo)法在不同的PCR反應(yīng)管中加入已知量的內(nèi)標(biāo)模板和引物，內(nèi)標(biāo)模板可由基因工程合成或采用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品。在樣品模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)模板也被擴增。二者的擴增產(chǎn)物可通過電泳或其它方法分離，以內(nèi)標(biāo)為對照進行樣本模板定量。第九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日競爭法將含有一個新內(nèi)切酶位點的外源性模板加入PCR反應(yīng)管中，待測樣品模板與外源性模板用同一對引物進行擴增，經(jīng)內(nèi)切酶消化競爭性模板的產(chǎn)物成為兩個片段，通過電泳等分離檢測，根據(jù)已知模板的量推測未知模板的起始拷貝數(shù)。第十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固定在固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，檢測酶底物顯色情況，通過內(nèi)標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)定量檢測的目的。第十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日參照物在PCR定量中的作用作為擴增系統(tǒng)的陽性對照；作為未知樣本定量的參比標(biāo)準(zhǔn)；通過競爭性作為矯正擴增系統(tǒng)內(nèi)部的擴增效率，使其具有可比性。（參照物按其性質(zhì)不同可分為內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)）第十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日內(nèi)標(biāo)基因的選擇原則：內(nèi)標(biāo)基因在不同組織或者處理前后表達量不變內(nèi)標(biāo)基因的選擇一般選取GAPDH、β-actin等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3－磷酸甘油醛脫氫酶)第十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足1.定量的準(zhǔn)確度：傳統(tǒng)PCR定量方法的共同特點是針對PCR擴增的最終產(chǎn)物進行分析。因受酶活性、擴增效率、尤其是平臺效應(yīng)等諸多因素的影響，檢測重現(xiàn)性極差，無法直接從終產(chǎn)物量推算出起始模板的精確含量。第十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足2.假陽性污染：傳統(tǒng)PCR定量方法均依賴于各種不同類型的PCR后處理過程，這些過程極易使數(shù)量巨大的PCR擴增產(chǎn)物飛散到實驗室的環(huán)境中，造成待檢樣本的污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的上升。第十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR

在PCR反應(yīng)體系中引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對每一循環(huán)擴增反應(yīng)產(chǎn)物DNA片段的累積情況進行實時監(jiān)測記錄，通過數(shù)學(xué)模型實現(xiàn)對起始模板的定量及定性的分析。其特點為全封閉（污染少）、高精確、高靈敏。第十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR：

通過電泳、酶聯(lián)等后處理技術(shù)，對PCR擴增反應(yīng)的終末產(chǎn)物進行定量及定性分析。實時熒光定量PCR：通過引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對PCR擴增反應(yīng)過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積進行實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。三個關(guān)鍵詞：實時，熒光，定量第十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日PCRRealtimePCRS1S2M實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別第十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體）的發(fā)射光譜與另一基團（受體）的激發(fā)光譜有一定的重疊，當(dāng)兩個基團之間的距離足夠近（小于100?）時，以供體基團的激發(fā)波長進行激發(fā)，可獲得由受體基團發(fā)射的熒光。第十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日熒光共振能量轉(zhuǎn)移即：在供體基團的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量直接轉(zhuǎn)移給了受體。在此過程中沒有光子的參與，是非輻射性的能量轉(zhuǎn)移過程，轉(zhuǎn)移效率與供－受體兩個基團之間距離的6次冪倒數(shù)成正比例。在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日FRET產(chǎn)生條件1.存在熒光供體和受體，而且供體的發(fā)色光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊常用的FRET組合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

第二十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

2供體和受體的距 離足夠近：1-10nm

（1－10nm為分子內(nèi)/ 間互作的距離：如蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、酶催 化反應(yīng)等。）

——超顯微觀察

3合適偶極方向

4足夠熒光壽命 無FRETFRETFRET產(chǎn)生條件第二十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日熒光域值線（fluorescencethresholdline）：背景熒光與熒光信號的分界值，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或經(jīng)驗來設(shè)定，常設(shè)定為初始3-7個循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR擴增過程中，各反應(yīng)管的熒光信號與熒光域值線的交叉點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)（指數(shù)擴增的開始階段）。在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第二十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)值存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可對樣本中目標(biāo)基因的含量進行精確計算。初始模板濃度的確定第二十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies第二十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日用Ct值定量的意義實時熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。第二十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性

第二十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日絕對定量成為可能靈敏度高可檢測10–100個細胞中１個拷貝數(shù)量的基因低拷貝基因的檢測細小倍數(shù)差異樣品的檢測實時熒光定量PCR的優(yōu)勢第二十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日線性范圍寬(6-9個數(shù)量級)

，無需稀釋高濃度樣品可以在一次實驗中同時檢測定量高表達和低表達基因熒光探針使PCR產(chǎn)物檢測特異性進一步提高全封閉無PCR后處理*幾乎沒有污染機會實時熒光定量PCR的優(yōu)勢第三十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

相對定量和絕對定量：相對定量指的是確定樣本中靶序列相對于另一參照樣本中靶序列量的變化值，絕對定量指的是確定樣本中靶序列的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的定量方法第三十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日相對定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較Ct值法絕對定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法實時熒光定量PCR的定量方法第三十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對量是未知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比值。相對定量方法第三十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日比較Ct法:運用數(shù)學(xué)公式計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來計算起始模板的量。前提：靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致。相對定量方法第三十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對量是已知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列的絕對含量。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常用作絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來換算成其拷貝數(shù)。絕對定量方法第三十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日DNA結(jié)合染色：SYBRGreen1水解探針：TaqManMolecularBeacons熒光標(biāo)記引物雜交探針實時熒光定量PCR使用的熒光化學(xué)方法第三十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreen1TaqMan

MolecularBeacons熒光化學(xué)試劑第三十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenISYBRGreen1第三十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第三十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理第四十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理第四十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日熒光強度Vs溫度熒光強度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI重新游離到溶液中Tm是熔解曲線的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲線分析第四十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日以熒光值隨溫度變化作負導(dǎo)-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲線分析第四十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日優(yōu)化的讀板溫度

-高于非特異產(chǎn)物的Tm值

-低于目標(biāo)產(chǎn)物的Tm值A(chǔ)mpliconNon-specificproducts熔解曲線分析的應(yīng)用第四十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日不同讀板溫度對實驗結(jié)果的影響：80℃第四十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日不同讀板溫度對實驗結(jié)果的影響：86℃第四十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計反應(yīng)體系的組成：傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系+SYBRGreenI1.SG濃度：終濃度1:5,000－1:100,000，一般為1:10,000—1:70,000第四十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

2.Primer濃度：設(shè)計原則同普通PCR

終濃度50nM－300nM

固定摸板濃度的梯度實驗不加摸板的對照實驗（NTC）

——有無非特異信號SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計第四十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

熔解曲線的分析——是否單峰

建議使用HPLC純化的引物3.MgCl2濃度

降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物

最低可至1.5nM同時做梯度實驗和NTC對照SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計第四十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

4.反應(yīng)溫度和時間參數(shù)：

反應(yīng)溫度參考所用酶的種類；

退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化；反應(yīng)時間與常規(guī)PCR類似；擴增片斷一般為200－300bp。SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計第五十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

SYBRGreenI的特點和不足不涉及特異的探針，方法設(shè)計簡單，特異性差；熒光強度依賴于體系中所有的dsDNA分子，不能區(qū)分引物二聚體、非特異性擴增片斷等；通過繪制溶解曲線可較好地保證特異性。

第五十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第五十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日TaqMan目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補第五十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第五十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計引物、探針設(shè)計原則：優(yōu)先選擇探針的序列；Tm值應(yīng)比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；長度不應(yīng)超過30堿基，18-30bp,optimal20

；5’端不應(yīng)是G，G有可能會淬滅熒光素。

第五十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計選擇合適的模板鏈，使探針的Cs>Gs；擴增片斷不超過400bp，通常為80－150bp。避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)，特別是四個或四個以上Gs連續(xù)出現(xiàn)；引物應(yīng)盡量靠近探針；引物的Tm值為59－60度，長度約20堿基；避免引物、探針之間的二級結(jié)構(gòu)。第五十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日引物、探針濃度的優(yōu)化

目標(biāo)：最高的信號/背景比，最小的Ct值

引物濃度：50nM－900nM

探針濃度：50nM－250nM

通過多次實驗確定各自的濃度和比例Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計第五十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Taqman探針的不足采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記，淬滅難以徹底，本底較高；采用酶外切活性，受酶性能影響；探針標(biāo)記成本較高。改進：用不發(fā)光的淬滅熒光分子取代TAMRA第五十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Molecular

BeaconsMolecularBeacons發(fā)夾型雜交探針第五十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日MolecularBeacons莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對莖熒光素淬滅劑環(huán)第六十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

第六十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日MolecularBeacons特點和不足對目標(biāo)序列有很高的特異性；是用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一；采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低；不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差；探針合成標(biāo)記較復(fù)雜。第六十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站

1．引物/探針的設(shè)計

?

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

?

GeneFisher(BielefeldUniversity)

?

第六十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

1．引物/探針的設(shè)計

?

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

?

PerlPrimer(OwenMarshall)

?

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站第六十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日．2.反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR引物設(shè)計

?

ExonPrimer(TechnischeUniversit?t,München)

?

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

3.引物特異性的驗證

?

Blast(NCBI)引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站第六十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日4．引物/探針特性的評估

?

OligoAnalyzer(IDT)

?

OligoAnalysis&PlottingTool(Operon/Qiagen)

?

NetPrimer(PremierBiosoft)

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站第六十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日

?

GeneWalker(Cybergene)

?

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

?

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站第六十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日5．?dāng)U增子二級結(jié)構(gòu)的評估

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站第六十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR的原理實時熒光定量PCR的應(yīng)用Chromo4介紹第六十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測；腫瘤研究；基因表達研究；免疫組份分析；基因突變及多態(tài)性的研究第七十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測：檢測患者血清中肝炎病毒濃度為臨床藥物治療和療效觀察提供依據(jù)；檢測HIV的量預(yù)測發(fā)病時間；選擇治療藥物：干擾素對肝炎病毒高拷貝者不敏感，對低拷貝者敏感。第七十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

腫瘤研究：癌基因及其相關(guān)基因的定量檢測可進行腫瘤的早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷；檢測治療中和治療后微量殘余惡性細胞存在的數(shù)量，作為治療效果和估計復(fù)發(fā)危險性的依據(jù)。第七十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日基因差異表達研究標(biāo)準(zhǔn)曲線法

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定基因表達上的差異相對定量法(2－△△Ct法)

不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接分析得到基因差異表達的倍數(shù)關(guān)系第七十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟：1.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測出目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比較不同樣品間目標(biāo)基因表達差異第七十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日相對定量法前提目標(biāo)基因和看家基因的擴增效率一致，且接近100％。步驟通過實時熒光曲線得到目標(biāo)基因和看家基因的Ct值均一化校準(zhǔn)△Ct=Ct目標(biāo)基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同時間、不同組織)基因差異表達的倍數(shù)＝2－△△Ct第七十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日基因突變及多態(tài)性-SNP檢測第七十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日基因分型方法

使用TaqMan探針

(雙色法)溶解曲線

(單色法)序列特異PCR

(單色法)第七十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探針進行基因型分析SNP檢測-基因型分析第七十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第七十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日從病人血液樣品中提取DNA基因型分類：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Allele1controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十一頁，共一百零二頁，2022年，8月28日Allele2controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十二頁，共一百零二頁，2022年，8月28日HeterozygotecontrolFAMVIC多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十三頁，共一百零二頁，2022年，8月28日多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第八十四頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI進行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配會導(dǎo)致PCR效率上有大約1000倍的差異，由此導(dǎo)致產(chǎn)物積累會有10個cycles延遲

末端匹配與否，與反應(yīng)終產(chǎn)物量的多少沒有必然聯(lián)系

PCR#1PCR#2第八十五頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI進行SNP分析MatchMismatch第八十六頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI進行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile第八十七頁，共一百零二頁，2022年，8月28日SYBRGreenI進行基因分型Intensity-dI/dT第八十八頁，共一百零二頁，2022年，8月28日TaqMan?MicroRNA分析方法

加長靶基因的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR第八十九頁，共一百零二頁，2022年，8月28日miRNAs的研究

MicroRNAs是一種內(nèi)源性長度在２２個堿基左右的RNA分子，它在動植物中具有重要的基因調(diào)控作用，它們通過與mRNAs結(jié)合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各種生命體中發(fā)現(xiàn)的miRNAs類型共有約700種以上,通過實驗驗證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫和軟件推測其中人源的約有２００種高豐度存在：平均每個細胞中約有50,000個拷貝第九十頁，共一百零二頁，2022年，8月28日為什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一類新的基因調(diào)控因子某些miRNAs控制了動植物的發(fā)育理解miRNA的功能將幫助現(xiàn)在流行的siRNA實驗結(jié)果：RNA干擾／基因沉默MicroRNAs有可能成為新型的疾病標(biāo)志物MicroRNAs可能具有重要臨床應(yīng)用價值第九十一頁，共一百零二