實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌基本檢驗(yàn)技術(shù)一

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌基本檢驗(yàn)技術(shù)一第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、常用消毒滅菌方法介紹

消毒與滅菌的方法

加熱

物理方法過濾

照射

化學(xué)方法一）加熱法

加熱法又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日1、干熱滅菌

火焰燒灼滅菌

熱空氣滅菌160℃-170℃2小時(shí)

適用于玻璃器皿如吸管和

培養(yǎng)皿等的滅菌2、濕熱滅菌

高壓蒸汽滅菌法

間歇滅菌法

煮沸消毒法第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日高壓蒸汽滅菌法1.05kg／cm2(15磅/英寸2)，121.3℃保持15-30分鐘；0.7kg／cm2(10磅/英寸2)，115.6℃保持20-30分鐘；適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等的滅菌；指示菌：菌種采用USP（美國藥典）31版和ISO11138（國際標(biāo)準(zhǔn)組織）指定的嗜熱脂肪芽孢桿菌（ATCC7953），本菌芽孢對熱的抗力較強(qiáng)，其熱死亡時(shí)間與病原微生物中抗力最強(qiáng)的肉毒桿菌芽孢相似。第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日間歇滅菌法阿諾氏流動蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌；100℃30分鐘

室溫下18-24小時(shí)100℃30分鐘

室溫下18-24小時(shí)100℃30分鐘；

有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌均會受到破壞，則必須用間歇滅菌法。煮沸消毒法煮沸消毒時(shí)間為10-15分鐘；注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日二）過濾滅菌

蔡氏(Seitz)過濾器

膜過濾器：多孔纖維素(乙酸纖維素或

硝酸纖維素)，孔徑一般為

0.45m/0.22m許多材料例如血清與糖溶液應(yīng)用一般加熱消毒滅菌方法，均會被熱破壞，因此，采用過濾除菌的方法。第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日三）紫外線滅菌（照射）紫外線波長在200-300nm，具有殺菌作用，其中以265-266nm殺菌力最強(qiáng)；照射劑量(J/m2)=照射時(shí)間（s）×UVC照射強(qiáng)度（w/m2）；適應(yīng)于室內(nèi)空氣、物體表面和水及其它液體的消毒。第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日四）化學(xué)方法

常用化學(xué)殺菌劑應(yīng)用范圍和常用濃度表類

別實(shí)

例常用濃度應(yīng)用范圍醇

類乙

醇50-70%皮膚及器械消毒酸

類

乳

酸0.33-lmol/L空氣消毒(噴霧或熏蒸)食

醋3-5m1/m3熏蒸消毒空氣，可預(yù)防流感病毒堿

類石灰水1-3%地面消毒酚

類石炭酸5%空氣消毒(噴霧)來蘇爾2-5%空氣消毒、皮膚消毒醛

類福爾馬林40%溶液2-6ml/m3

接種室、接種箱或廠房熏蒸消毒重金屬離子升

汞0.1%植物組織(如根瘤)表面消毒硝酸銀0.1-1%皮膚消毒氧化劑高錳酸鉀0.1-3%皮膚、水果、茶杯消毒過氧化氫3%清洗傷口氯

氣0.2-1ppm飲用水清潔消毒漂白粉l-5%洗刷培養(yǎng)基、飲水及糞便消毒去污劑新潔爾滅水稀釋20倍

皮膚，不能遇熱的器皿消毒染

料

結(jié)晶紫2-4%外用紫藥水，淺創(chuàng)傷口消毒金屬螯合劑8-羥奎啉硫酸鹽

0.1-0.2%外用、清洗消毒第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、微生物實(shí)驗(yàn)中常用器材的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜の⑸飳?shí)驗(yàn)中常用器材；了解各種器材在使用前的準(zhǔn)備及清潔工作。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：玻璃器皿的清潔法1、新玻璃器皿：因含有游離堿，應(yīng)先在清潔液或2%鹽酸內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，再用自來水清洗干凈。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、用過的玻璃器材：凡培養(yǎng)了細(xì)菌或污染有活菌的玻璃器皿，均可直接投入5％碳酸氫鈉水鍋中煮沸30分鐘，趁熱倒出器皿內(nèi)的內(nèi)容物，再用熱肥皂水洗刷，最后用自來水沖洗干凈。沾有凡士林或石蠟的器皿，應(yīng)單獨(dú)高壓滅菌，然后趁熱倒出內(nèi)容物，將試管等倒立于吸水紙上置100℃烤箱內(nèi)半小時(shí)，吸出油污，再放入5％碳酸氫鈉水中煮兩次，然后用肥皂水洗刷干凈，涼干或烤干備用。第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日染有活菌的吸管應(yīng)投入3％來蘇液內(nèi)浸泡30分鐘，再用肥皂水洗滌一次，最后用自來水沖洗干凈。

染有活菌的玻片，可浸入3％來蘇液或清潔液中過夜，取出后水洗。細(xì)菌染色之載玻片放入5％肥皂水中煮沸10分鐘，刷洗干凈，再清水沖洗，最后浸入95％酒精中片刻，取出軟布擦干備用。第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日玻璃器皿的包扎和滅菌培養(yǎng)皿（簡稱平皿）：包扎：培養(yǎng)皿由蓋皿和底皿組成，先將蓋皿和底皿套合后，數(shù)個(gè)（10個(gè)或15個(gè)或隨意性）一疊用紙包裹或裝在金屬的平皿框架內(nèi)。滅菌：160℃干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽滅菌15磅/寸2滅菌20分鐘，再置烤箱內(nèi)烤干備用。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日試管：包扎：培養(yǎng)用的試管，其管口必須用棉塞塞緊。棉塞制作法：取大小合適的棉花塊（視管口口徑大小而定），松松地卷成圓筒，將兩端毛邊略向內(nèi)折入，再逢腰折轉(zhuǎn)，在折端套一大小合適的紗布塊，塞入試管口內(nèi)，紗布的散端可用線扎緊，剪去須尾。棉塞的要求：①、要有適當(dāng)?shù)拈L度，2/3塞入試管內(nèi)，1/3露于管口外；②、大小適宜，應(yīng)手持棉塞外露部分時(shí)試管不掉離棉塞，同時(shí)又能輕輕拔出（過松達(dá)不到濾菌的目的，過緊妨礙空氣流通）；第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日吸管及毛細(xì)吸管：

包扎：（管口要求塞棉花）以拇、食指持一端拉直的回形針，并以食指夾取少許棉花（根據(jù)吸管孔徑大小確定棉花多少），輕輕從管口端塞入1.5～2cm，抽出回形針。塞入的棉花松緊必須適中，過松時(shí)使用中棉花容易脫落，過緊時(shí)吹吸時(shí)流速太慢，管口露出的棉花纖維可在酒精燈火焰上燒去。管口塞好棉花后將吸管尖斜置于一條約4×40cm左右的紙條上，離終端4cm，將紙條包住吸管的尖端向前稍微滾動，使將管尖包裹，再將紙條末端折疊包嚴(yán)吸管尖端，將吸管繼續(xù)滾動至紙將吸管全部包嚴(yán)。第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日燒瓶：包扎：按瓶口大小，用上述方法制成棉塞塞入瓶口，再在棉塞外包以厚紙，用紗繩以活結(jié)扎緊，以防滅菌后瓶口被外界細(xì)菌污染。第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日棉簽（棉拭）：棉簽制作：取稍許脫脂棉，做成一定形狀置于左手中指上，用一竹簽自前向后卷入少許棉花，然后將竹簽前端棉花折入，再繼續(xù)滾動棉簽（滾動過程中以食指抵住竹簽前端）直至將所取棉花全部卷緊即成。包扎：取15～20根棉簽，用紙包好或插入試管內(nèi)，塞好棉塞，滅菌備用。第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用培養(yǎng)基的制備

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饧?xì)菌培養(yǎng)基的制備原則和基本程序，熟悉常用培養(yǎng)基的種類與名稱。熟悉葡萄糖發(fā)酵管、肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基等的配制第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基配制的基本程序稱量（按一定配方稱量各種物質(zhì)）→溶解→測定及調(diào)整PH→濾過→分裝→滅菌、備用。第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日四、細(xì)菌的接種培養(yǎng)與生長現(xiàn)象觀察

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模撼醪秸莆占?xì)菌接種的無菌操作技術(shù)要領(lǐng)；學(xué)會常用的幾種接種細(xì)菌的方法；學(xué)會觀察和描述細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)材料：菌種：金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的24h斜面培養(yǎng)物培養(yǎng)基：普通瓊脂平板、肉膏湯、半固體培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面培養(yǎng)基其它：接種環(huán)、接種針、特種蠟筆、酒精燈、37℃恒溫培養(yǎng)箱等第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)菌接種與培養(yǎng)方法1、液體培養(yǎng)基（肉湯）的接種方法：主要用于增菌培養(yǎng)及檢測細(xì)菌的生化反應(yīng)左手拇指、食指、中指及無名指分別握持菌種管與待接種的培養(yǎng)基管使菌種管在外，培養(yǎng)基管位里。右手拇、食指先轉(zhuǎn)動兩管棉塞，以便接種時(shí)易于拔取。右手持接種環(huán)，燒灼滅菌，柄部也要迅速通過火焰2~3次殺滅表面的雜菌，滅菌后拿在手中，勿與其它物接觸。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日以右手無名指與小指拔取菌種管棉塞，再用手掌與小指拔取待接種管，隨后將兩管管口迅速通過火焰滅菌。用滅菌后冷卻的接種環(huán)伸入菌種管，從斜面上挑取不許菌苔，退出管后再伸入肉湯管中，在接近液面與管壁處輕輕研磨（圖1）并沾取少許肉湯調(diào)和，使菌混于肉湯中。接種畢，接種環(huán)滅菌后放下。分別塞好棉塞，立于試管架上，37℃孵育18~24小時(shí)，觀察生長情況。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日圖1液體培養(yǎng)基接種法第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、半固體培養(yǎng)基接種法：只能用接種針接種，主要用于細(xì)菌動力觀察，保存菌種左手握持菌種管及待接種管（方法同前）右手持接種針火焰滅菌，挑取少許菌苔，于待接種培養(yǎng)基中心垂直插入（圖2）近管底處，然后轉(zhuǎn)動接種針原路退出；接種畢，接種針滅菌后放下，分別塞好棉塞。37℃孵育18~24小時(shí)，觀察有無細(xì)菌生長，細(xì)菌有無動力。第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日圖2半固體培養(yǎng)基接種方法第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日3、斜面培養(yǎng)基接種方法：主要用于純培養(yǎng)和細(xì)菌菌種保存如液體培養(yǎng)基接種法，左手握持菌種管及待接種管。用滅菌后冷卻的接種環(huán)伸入菌種管，從斜面上挑取不許菌苔，退出管后再伸入待接種管，自斜面底部輕輕向上部蜿蜒劃線或自斜面底部輕輕向上部劃一直線，再回到斜面底部向上部蜿蜒劃線（勿觸破培養(yǎng)基表面，沾菌的接種環(huán)進(jìn)出試管時(shí)不應(yīng)觸及度管內(nèi)避）。接種畢，接種環(huán)火焰滅菌后放下。兩管口迅速通過火焰2~3次滅菌，先將指掌間棉塞塞入接菌管內(nèi)，后將無名指、小指間棉塞塞入菌種管上，將管放回原處。37℃孵育18~24小時(shí)，觀察生長情況。第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日圖3斜面培養(yǎng)基接種法第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日4、瓊脂平板接種方法：只能用接種環(huán)接種連續(xù)劃線法右手持接種環(huán)在火焰上滅菌待冷（約2~5秒鐘）取稍許菌種。左手抓握平板培養(yǎng)基，微開皿蓋，接種環(huán)與培養(yǎng)基表面成45度角，在平板一側(cè)邊緣反復(fù)來回劃線（此稱原劃線），然后運(yùn)用腕力向兩側(cè)作“Z”形劃線，劃線向下延伸，直至劃完整個(gè)平板（注意劃線不能接觸平皿邊緣，要?jiǎng)蛑?，不劃爛培養(yǎng)基，要充分利用平板）第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

圖4平板連續(xù)劃線法圖5培養(yǎng)后菌落的分布情況第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日分區(qū)劃線法

用接種環(huán)取菌做原劃線后先在平板1/4面積處劃線，再把平板旋轉(zhuǎn)一定角度，將接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后做第二區(qū)劃線，起始每條劃線都與第一區(qū)劃線相交，相交數(shù)次后劃線不必再相交接，待第二區(qū)劃線完時(shí)，滅菌接種環(huán)，按上法劃第三區(qū)、第四區(qū)劃線。第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日圖6平板分區(qū)劃線法

圖7培養(yǎng)后菌落的分布情況第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日細(xì)菌的生長現(xiàn)象觀察1、液體培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象觀察：培養(yǎng)前的液體培養(yǎng)基多為清徹透明的。接種細(xì)菌后，由于細(xì)菌種類不同，可有以下三種生長形式?；鞚幔阂后w變?yōu)榛鞚?。菌膜：液體澄清，表面有一薄膜。沉淀：管底有沉淀物，液體澄清。第三十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、半固體中生長現(xiàn)象觀察：

無鞭毛（無運(yùn)動）的細(xì)菌：經(jīng)培養(yǎng)后僅沿穿刺線生長，培養(yǎng)基清亮。

有鞭毛（