實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒的制備和酶切

實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒的制備和酶切第一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日1、質(zhì)粒DNA的提取第二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。第三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)粒特點(diǎn)質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細(xì)菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。第四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和

嚴(yán)緊型質(zhì)粒1.松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。第五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過(guò)用氯霉素等蛋白合成抑制劑來(lái)增加。第六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日本實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。第八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的堿變性法；煮沸法；SDS法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。第九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日堿變性法基本原理在堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。第十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)試劑

ＬＢ培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：

0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鮮配制）第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日試劑溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase瓊脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日EnzymeswhichcutpBluescriptIIKS(+)DNAonce:

Acc65I755,AdeI222,AflIII1153,AloI169,ApaI749,BamHI689,BcgI2562,BcuI683,BsaAI225,Bsp120I749,BstXI658,Bsu15I725,BtgI661,

CaiI1564,Cfr9I695,Cfr42I661,Eam1105I2041,Ecl136II653,Eco31I2113,Eco32I713,Eco52I670,EcoO109I748,EcoRI707,FaqI

457,

GsuI2131,Hin1I2582,HincII734,HindIII719,KpnI755,NotI669,OliI659,PdiI328,PdmI2641,PscI1153,PsiI97,PstI701,SacI653,SalI734,SapI1030,ScaI2524,SmaI695,TatI2524,XbaI677,XceI1153,XhoI740,XmiI734.第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日三．實(shí)驗(yàn)方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中（含AmP50μg/ml），３７℃強(qiáng)烈搖蕩過(guò)夜。２．取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用１mlSTE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。３．將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl預(yù)冷溶液Ⅰ中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘。４．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒５次以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘。５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。６．12000g4℃離心５分鐘，取上清移到１個(gè)新的Eppendorf管中。第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。

６．12000g4℃離心５分鐘，取上清移到１個(gè)新的Eppendorf管中。(７．加入等體積酚/氯仿（１：１），振蕩混勻，12000g4℃離心２分鐘。取上清移至另１個(gè)Eppendorf管中。)８．加入２倍體積無(wú)水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。９．１２０００g,4℃離心５分鐘。１０．棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，１２000g于4℃離心２分鐘。１１．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交給助教加RNA酶，之后37℃10分鐘。第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交給助教加RNA酶，之后37℃10分鐘。13．取2μlDNA溶解液用ＴＥ稀釋至200ul測(cè)定OD260和OD280,計(jì)算OD260/OD280之比；14.同時(shí)以以下公式計(jì)算得率。質(zhì)粒DNA得率：稀釋倍數(shù)×OD260×0.05×50/1.5ml15．做酶切之后剩余的質(zhì)粒全部上交用來(lái)電泳,電泳0.5小時(shí),電壓200伏。16．電泳凝膠在透射式紫外檢測(cè)儀上觀察，記錄結(jié)果。第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日四．結(jié)果分析１．質(zhì)粒DNAOD260,OD280的值，由此計(jì)算質(zhì)粒DNA得率和ＤＮＡ純度。２．記錄電泳結(jié)果并說(shuō)明結(jié)果內(nèi)容。第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日問(wèn)題與討論：

１．簡(jiǎn)要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實(shí)驗(yàn)中分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。２．簡(jiǎn)要敘述酚氯仿抽提ＤＮＡ體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。3.沉淀ＤＮＡ?xí)r為什么要用無(wú)水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行？第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日2、ＤＮＡ的酶切

第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來(lái)ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日限制酶的類型根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。Ⅰ類和Ⅲ類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。Ⅰ類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識(shí)別位點(diǎn)，且沒(méi)有特定的切割位點(diǎn)，酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來(lái)。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶.它們能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為４～６個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題：１．內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)及形成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定，通常1u指在適當(dāng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以１ugDNA對(duì)２－３u酶短時(shí)間為宜。同時(shí)內(nèi)切酶體積不能超過(guò)反應(yīng)體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過(guò)５％會(huì)抑制內(nèi)切酶活力；內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止操作中對(duì)內(nèi)切酶的污染。第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日２．ＤＮＡ：作為內(nèi)切酶底物，ＤＮＡ應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。這種抑制可通過(guò)：增加酶作用單位數(shù)（10~20U/ugDNA）、增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間加以克服。第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日３．反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基；Tris·HCl維持反應(yīng)體系pH值在之間；NaCl濃度不同形成３種級(jí)別的離子強(qiáng)度：低鹽（10mMNaCl)中鹽（50mMNaCl）高鹽（100mMNaCl）不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日４．酶解溫度與時(shí)間：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的單位與ＤＮＡ用量之比來(lái)定，原則是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小時(shí)即可，充分酶解。第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶ＤＮＡ（λＤＮＡ和質(zhì)粒ＤＮＡ）１０×buffer:50mMTrisHClpH7.5100mMNaCl10mMMgCl2無(wú)菌水第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日三．實(shí)驗(yàn)方法

１．按下表分別加入各試劑（注意限制性內(nèi)切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA１μg10×buffer2.5μl無(wú)菌水內(nèi)切酶2μ總體積：25μl第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

２．將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心。３．Eppendorf管封上封口膜于３７℃水管中反應(yīng)２小時(shí)。４．反應(yīng)結(jié)束后加入EDTA至終濃度10mM終止反應(yīng)。５．?。保唉蘬反應(yīng)液加２μlLoadingbuffer混勻于１％瓊脂糖凝膠上４０伏電泳２－３小時(shí)。６．紫外透射儀上檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日四．結(jié)果與分析

１．記錄紫外透射儀上觀察到的結(jié)果。２．分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成因。問(wèn)題與討論：１．在整個(gè)酶切反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？２．如何選擇ＤＮＡ和限制性內(nèi)切酶的用量？反應(yīng)體系中為何內(nèi)切酶用量不能超過(guò)整個(gè)反應(yīng)體系的１０％？第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日RestrictionEndonucleases:

AnOverviewRestrictionenzymeswerediscoveredabout30yearsagoduringinvestigationsintothephenomenonofhost-specificrestrictionandmodificationofbacterialviruses.Bacteriainitiallyresistinfectionsbynewviruses,andthis"restriction"ofviralgrowthstemmedfromendonucleaseswithinthecellsthatdestroyforeignDNAmolecules.Amongthefirstofthese"restrictionenzymes"tobepurifiedwereEcoR

IandEcoRIIfromEscherichiacoli,andHindIIandHindIIIfromHaemophilusinfluenzae.TheseenzymeswerefoundtocleaveDNAatspecificsites,generatingdiscrete,gene-sizefragmentsthatcouldbere-joinedinthelaboratory.Researcherswerequicktorecognizethatrestrictionenzymesprovidedthemwitharemarkablenewtoolforinvestigatinggeneorganization,functionandexpression.Astheuseofrestrictionenzymesspreadamongmolecularbiologistsinthelate1970’s,companiessuchasNewEnglandBiolabsbegantosearchformore.Exceptforcertainviruses,restrictionenzymeswerefoundonlywithinprokaryotes.Manythousandsofbacteriaandarchaehavenowbeenscreenedfortheirpresence.Analysisofsequencedprokaryoticgenomesindicatesthattheyarecommon--allfree-livingbacteriaandarchaeaappeartocodeforthem.Restrictionenzymesareexceedinglyvaried;theyrangeinsizefromthediminutivePvuII(157aminoacids)tothegiantCjeI(1250aminoacids)andbeyond.Amongover3,000activitiesthathavebeenpurifiedandcharacterized,morethan250differentsequence-specificitieshavebeendiscovered.Ofthese,over30%werediscoveredandcharacterizedatNewEnglandBiolabs.第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日Thesearchfornewspecificitiescontinues,bothbiochemically,bytheanalysisofcell-extracts,andcomputationally,bytheanalysisofsequencedgenomes.Althoughmostactivitiesencounteredtodayturnouttobeduplicates--isoschizomers--ofexistingspecificities,restrictionenzymeswithnewspecificitiesarefoundwithregularity.Beginningintheearly1980’s,NewEnglandBiolabsembarkedonaprogramtocloneandoverexpressthegenesforrestrictionenzymes.Cloningimprovesenzymepuritybyseparatingenzymesfromcontaminatingactivitiespresentinthesamecells.Italsoimprovesenzymeyieldsandgreatlysimplifiespurification,anditprovidesthegenesforsequencingandanalysis,andtheproteinsforx-raycrystallography.Restrictionenzymesprotectbacteriafrominfectionsbyviruses,anditisgenerallyacceptedthatthisistheirroleinnature.Theyfunctionasmicrobialimmunesystems.WhenastrainofE.colilackingarestrictionenzymeisinfectedwithavirus,mostvirusparticlescaninitiateasuccessfulinfection.Whenthesamestraincontainsarestrictionenzyme,however,theprobabilityofsuccessfulinfectionplummets.Thepresenceofadditionalenzymeshasamultiplicativeeffect;acellwithfourorfiveindependentrestrictionenzymescouldbevirtuallyimpregnable.第三十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

Restrictionenzymesusuallyoccurincombinationwithoneortwomodificationenzymes(DNA-methyltransferases)thatprotectthecell’sownDNAfromcleavagebytherestrictionenzyme.ModificationenzymesrecognizethesameDNAsequenceastherestrictionenzymethattheyaccompany,butinsteadofcleavingthesequence,theymethylateoneofthebasesineachoftheDNAstrands.ThemethylgroupsprotrudeintothemajorgrooveofDNAatthebindingsiteandpreventtherestrictionenzymefromactinguponit.Together,arestrictionenzymeandits"cognate"modificationenzyme(s)formarestriction-modification(R-M)system.InsomeR-Msystemstherestrictionenzymeandthemodificatione