實驗九質粒的制備和酶切

實驗九質粒的制備和酶切第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日1、質粒DNA的提取第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日一．實驗目的及背景

質粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細菌的質粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內的共生型遺傳因子。其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制和轉錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日質粒特點質粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。質粒通過細菌的結合作用，從雄性體轉移到雌性體，是細菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名為質粒。第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日質粒類型質粒按復制方式分為兩種類型：松弛型質粒和

嚴緊型質粒1.松弛型質粒松弛型質粒的復制不需要質粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質合成受抑制，質粒的復制依然進行。當抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素等抗生素存在時，質粒的拷貝數(shù)可達2000-3000拷貝。第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日2.嚴緊型質粒嚴緊型質粒復制需要一個質粒編碼的蛋白，質粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日質粒的應用大多數(shù)基因工程使用松弛型質粒。嚴緊型質粒用來表達一些可使宿主細胞受毒害致死的基因。質粒的特點使質粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值。第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日本實驗目的本實驗要求掌握最常用的質粒的提取方法。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日分離質粒DNA方法從大腸桿菌中分離質粒DNA方法眾多，目前常用的堿變性法；煮沸法；SDS法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成及結構等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高,提取的質粒DNA可用于酶切,連接與轉化。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日堿變性法基本原理在堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構，大部分DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質粒DNA。第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日

實驗試劑

ＬＢ培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：

0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鮮配制）第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日試劑溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase瓊脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日EnzymeswhichcutpBluescriptIIKS(+)DNAonce:

Acc65I755,AdeI222,AflIII1153,AloI169,ApaI749,BamHI689,BcgI2562,BcuI683,BsaAI225,Bsp120I749,BstXI658,Bsu15I725,BtgI661,

CaiI1564,Cfr9I695,Cfr42I661,Eam1105I2041,Ecl136II653,Eco31I2113,Eco32I713,Eco52I670,EcoO109I748,EcoRI707,FaqI

457,

GsuI2131,Hin1I2582,HincII734,HindIII719,KpnI755,NotI669,OliI659,PdiI328,PdmI2641,PscI1153,PsiI97,PstI701,SacI653,SalI734,SapI1030,ScaI2524,SmaI695,TatI2524,XbaI677,XceI1153,XhoI740,XmiI734.第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日三．實驗方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中（含AmP50μg/ml），３７℃強烈搖蕩過夜。２．取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用１mlSTE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復一次，棄上清，取沉淀。３．將細菌沉淀懸浮于100μl預冷溶液Ⅰ中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘。４．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴管蓋輕柔顛倒５次以混勻內容物，冰上放置5分鐘。５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。６．12000g4℃離心５分鐘，取上清移到１個新的Eppendorf管中。第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。

６．12000g4℃離心５分鐘，取上清移到１個新的Eppendorf管中。(７．加入等體積酚/氯仿（１：１），振蕩混勻，12000g4℃離心２分鐘。取上清移至另１個Eppendorf管中。)８．加入２倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。９．１２０００g,4℃離心５分鐘。１０．棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴管蓋顛倒數(shù)次，１２000g于4℃離心２分鐘。１１．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交給助教加RNA酶，之后37℃10分鐘。第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交給助教加RNA酶，之后37℃10分鐘。13．取2μlDNA溶解液用ＴＥ稀釋至200ul測定OD260和OD280,計算OD260/OD280之比；14.同時以以下公式計算得率。質粒DNA得率：稀釋倍數(shù)×OD260×0.05×50/1.5ml15．做酶切之后剩余的質粒全部上交用來電泳,電泳0.5小時,電壓200伏。16．電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結果。第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日四．結果分析１．質粒DNAOD260,OD280的值，由此計算質粒DNA得率和ＤＮＡ純度。２．記錄電泳結果并說明結果內容。第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日問題與討論：

１．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實驗中分別加入上述溶液后，反應體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。２．簡要敘述酚氯仿抽提ＤＮＡ體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。3.沉淀ＤＮＡ時為什么要用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進行？第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、ＤＮＡ的酶切

第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日一．實驗目的及背景

核酸限制性內切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內切酶以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日限制酶的類型根據(jù)限制酶的識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。Ⅰ類和Ⅲ類限制性內切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內切酶活性。Ⅰ類限制性內切酶結合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。Ⅲ類限制性內切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內切酶.它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內進行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉重復順序；Ⅱ型內切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內切酶的發(fā)現(xiàn)和應用，才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質ＤＮＡ進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發(fā)展。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日酶切反應中應注意以下幾個問題：１．內切酶：不應混有其它雜蛋白特別是其它內切酶或外切酶的污染；注意內切酶的識別位點及形成的粘性末端；內切酶的用量根據(jù)內切酶單位和ＤＮＡ用量而定，通常1u指在適當條件下，1小時內完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性內切酶量，使用中一般以１ugDNA對２－３u酶短時間為宜。同時內切酶體積不能超過反應體系１０％，因內切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會抑制內切酶活力；內切酶操作應在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內切酶的污染。第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日２．ＤＮＡ：作為內切酶底物，ＤＮＡ應該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內切酶的活力。這種抑制可通過：增加酶作用單位數(shù)（10~20U/ugDNA）、增大反應體積以稀釋可能的抑制劑或延長反應時間加以克服。第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日３．反應緩沖液：反應緩沖液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內切酶輔基；Tris·HCl維持反應體系pH值在之間；NaCl濃度不同形成３種級別的離子強度：低鹽（10mMNaCl)中鹽（50mMNaCl）高鹽（100mMNaCl）不同的內切酶選擇特定的反應緩沖液。第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日４．酶解溫度與時間：大多數(shù)限制酶反應溫度為３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下進行反應，反應時間根據(jù)酶的單位與ＤＮＡ用量之比來定，原則是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小時即可，充分酶解。第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、實驗試劑

限制性內切酶ＤＮＡ（λＤＮＡ和質粒ＤＮＡ）１０×buffer:50mMTrisHClpH7.5100mMNaCl10mMMgCl2無菌水第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日三．實驗方法

１．按下表分別加入各試劑（注意限制性內切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA１μg10×buffer2.5μl無菌水內切酶2μ總體積：25μl第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

２．將反應體系充分混勻，并于臺式離心機上短暫離心。３．Eppendorf管封上封口膜于３７℃水管中反應２小時。４．反應結束后加入EDTA至終濃度10mM終止反應。５．?。保唉蘬反應液加２μlLoadingbuffer混勻于１％瓊脂糖凝膠上４０伏電泳２－３小時。６．紫外透射儀上檢查實驗結果。第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日四．結果與分析

１．記錄紫外透射儀上觀察到的結果。２．分析實驗結果的成因。問題與討論：１．在整個酶切反應過程中應注意哪些問題？２．如何選擇ＤＮＡ和限制性內切酶的用量？反應體系中為何內切酶用量不能超過整個反應體系的１０％？第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日RestrictionEndonucleases:

AnOverviewRestrictionenzymeswerediscoveredabout30yearsagoduringinvestigationsintothephenomenonofhost-specificrestrictionandmodificationofbacterialviruses.Bacteriainitiallyresistinfectionsbynewviruses,andthis"restriction"ofviralgrowthstemmedfromendonucleaseswithinthecellsthatdestroyforeignDNAmolecules.Amongthefirstofthese"restrictionenzymes"tobepurifiedwereEcoR

IandEcoRIIfromEscherichiacoli,andHindIIandHindIIIfromHaemophilusinfluenzae.TheseenzymeswerefoundtocleaveDNAatspecificsites,generatingdiscrete,gene-sizefragmentsthatcouldbere-joinedinthelaboratory.Researcherswerequicktorecognizethatrestrictionenzymesprovidedthemwitharemarkablenewtoolforinvestigatinggeneorganization,functionandexpression.Astheuseofrestrictionenzymesspreadamongmolecularbiologistsinthelate1970’s,companiessuchasNewEnglandBiolabsbegantosearchformore.Exceptforcertainviruses,restrictionenzymeswerefoundonlywithinprokaryotes.Manythousandsofbacteriaandarchaehavenowbeenscreenedfortheirpresence.Analysisofsequencedprokaryoticgenomesindicatesthattheyarecommon--allfree-livingbacteriaandarchaeaappeartocodeforthem.Restrictionenzymesareexceedinglyvaried;theyrangeinsizefromthediminutivePvuII(157aminoacids)tothegiantCjeI(1250aminoacids)andbeyond.Amongover3,000activitiesthathavebeenpurifiedandcharacterized,morethan250differentsequence-specificitieshavebeendiscovered.Ofthese,over30%werediscoveredandcharacterizedatNewEnglandBiolabs.第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日Thesearchfornewspecificitiescontinues,bothbiochemically,bytheanalysisofcell-extracts,andcomputationally,bytheanalysisofsequencedgenomes.Althoughmostactivitiesencounteredtodayturnouttobeduplicates--isoschizomers--ofexistingspecificities,restrictionenzymeswithnewspecificitiesarefoundwithregularity.Beginningintheearly1980’s,NewEnglandBiolabsembarkedonaprogramtocloneandoverexpressthegenesforrestrictionenzymes.Cloningimprovesenzymepuritybyseparatingenzymesfromcontaminatingactivitiespresentinthesamecells.Italsoimprovesenzymeyieldsandgreatlysimplifiespurification,anditprovidesthegenesforsequencingandanalysis,andtheproteinsforx-raycrystallography.Restrictionenzymesprotectbacteriafrominfectionsbyviruses,anditisgenerallyacceptedthatthisistheirroleinnature.Theyfunctionasmicrobialimmunesystems.WhenastrainofE.colilackingarestrictionenzymeisinfectedwithavirus,mostvirusparticlescaninitiateasuccessfulinfection.Whenthesamestraincontainsarestrictionenzyme,however,theprobabilityofsuccessfulinfectionplummets.Thepresenceofadditionalenzymeshasamultiplicativeeffect;acellwithfourorfiveindependentrestrictionenzymescouldbevirtuallyimpregnable.第三十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日

Restrictionenzymesusuallyoccurincombinationwithoneortwomodificationenzymes(DNA-methyltransferases)thatprotectthecell’sownDNAfromcleavagebytherestrictionenzyme.ModificationenzymesrecognizethesameDNAsequenceastherestrictionenzymethattheyaccompany,butinsteadofcleavingthesequence,theymethylateoneofthebasesineachoftheDNAstrands.ThemethylgroupsprotrudeintothemajorgrooveofDNAatthebindingsiteandpreventtherestrictionenzymefromactinguponit.Together,arestrictionenzymeandits"cognate"modificationenzyme(s)formarestriction-modification(R-M)system.InsomeR-Msystemstherestrictionenzymeandthemodificatione