實驗酶切連接及電泳檢測

實驗酶切連接及電泳檢測第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日

質(zhì)粒在正常情況下以共價閉合環(huán)狀cccDNA構(gòu)型(超螺旋scDNA)存在，在提取過程中由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會使DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價閉合環(huán)狀/超螺旋DNA(cccDNA)；開環(huán)DNA(ocDNA）；線形DNA(LDNA)質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖關(guān)于電泳條帶第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日質(zhì)粒DNA的帶型分析MpUC19環(huán)形質(zhì)粒DNA超螺旋粒DNA第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日出現(xiàn)問題電泳條帶濃度和純度電泳條帶拖尾現(xiàn)象（加樣過多，離子濃度，膠未完全凝固）質(zhì)粒DNA的帶型分析第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日實驗六

DNA的酶切、連接及電泳檢測第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日實驗步驟（一）質(zhì)粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：μl）↓混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃(PCR儀)保溫1-2h進(jìn)行酶切反應(yīng)?！磻?yīng)結(jié)束后，75℃，保溫10min使酶失活?！娪緳z測

樣品代號成份

反應(yīng)1（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)ddH2O無菌水(μl)7pUC19質(zhì)粒(μl)1010*H酶切緩沖液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日酶切樣品代號成份

反應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)ddH2O無菌水(μl)7pUC19質(zhì)粒(μl)1010*H酶切緩沖液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日（二）DNA片段的連接(注：每人一管）取200μl的離心管按下表加入試劑。↓混勻后點動離心，將溶液甩至管底↓置于已調(diào)好溫度為12℃-16℃PCR儀中↓保溫1-2h后取出↓電泳檢測樣品代號成分用量（μl）ddH2OddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.010*T4連接緩沖液2.0T4T4DNA連接酶1.0總體積20第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日連接樣品代號成分用量（μl）HddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.0Buffer連接緩沖液2.0T4T4DNA連接酶1.0總體積20第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日（三）質(zhì)粒酶切樣品和DNA連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊0.7%（0.28g/40ml）和2塊1.2%瓊脂糖凝膠（0.48g/40ml）。（注：全班制備4塊膠）第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日1、掌握限制性內(nèi)切酶的特性及酶切體系的建立；2、了解影響酶切的因素；3、掌握DNA連接酶的性質(zhì)以及連接體系的建立；4、了解影響連接反應(yīng)的因素。實驗?zāi)康牡谑豁摚菜氖屙摚?022年，8月28日通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建DNA重組子

利用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA+利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)提供了有效的實驗材料。第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1965年WernerArber第一個描述了限制性內(nèi)切現(xiàn)象；HamiltonO.Smith第一個純化了限制性內(nèi)切酶，并鑒定了其性質(zhì)；DanielNathans用這些酶將SV40病毒的DNA切割成了特定的片段，并繪制了SV40病毒基因組的“物理圖譜”。1978年這三人獲得了當(dāng)年的Nobel獎。ArberW.SmithH.O.NathansD.第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日第一個DNA重組分子1972年P(guān)aulBerg等人利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和連接酶獲得了第一個DNA重組分子。標(biāo)志著遺傳工程的開始。TheNobelPrizeinChemistry1980

PaulBerg第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建DNA重組子酶切連接第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日實驗原理–

酶切

限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。

限制性內(nèi)切酶能特異性地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。

第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶。第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日

根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三類。DNA重組技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型切割位點則在下游24-26bp處。Ⅰ類需Mg2+、SAM及ATP識別位點復(fù)雜，特異性差，切割位點距識別點遠(yuǎn)。Ⅱ類僅需Mg2+識別切割特異性強(qiáng)，切割發(fā)生在識別位點。Ⅲ類需Mg2+及ATP切割位點在識別位點周圍，酶活性不單一。第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日命名一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)。例如，從BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性內(nèi)切酶稱為BamH，在同一品系細(xì)菌中得到的識別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日II型限制性內(nèi)切酶主要特點：識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。在分子克隆實驗中使用最普遍的是那些識別4個或6個堿基對的限制性內(nèi)切酶。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端和平頭末端。如:EcoRI的識別順序為：

5’……GAATTC……3’

3’…….CTTAAG……5’回文結(jié)構(gòu)的對稱軸第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日

限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，1個酶單位（1Unit）指的是在指定緩沖液中，37℃下反應(yīng)60min,完全酶切1μg的純DNA所用的酶量。

影響酶切的因素：在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩沖液中的離子強(qiáng)度、Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長反應(yīng)時間等措施以達(dá)到完全酶切。但應(yīng)該注意的是，過多的酶量和過長的反應(yīng)時間會造成非特異性的酶切(星號活性)。圖:構(gòu)建DNA重組子第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日材料、試劑及器具1、材料與試劑酶切反應(yīng)：標(biāo)準(zhǔn)pUC19(2686bp)EcoRⅠ及其配套的酶切緩沖液檢測：0.5×TBE電泳緩沖液6×電泳載樣緩沖液、Goldview、瓊脂糖第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日2、器具：水平式電泳裝置電泳儀,臺式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋（用PCR儀代理）微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相機(jī)及其附件第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日實驗步驟（一）質(zhì)粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：μl）↓混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃(PCR儀)保溫1-2h進(jìn)行酶切反應(yīng)?！磻?yīng)結(jié)束后，75℃，保溫10min使酶失活。↓電泳檢測

樣品代號成份

反應(yīng)1（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)無菌水(μl)2P質(zhì)粒(μl)6H酶切緩沖液(μl)1EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)10第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日（三）質(zhì)粒酶切樣品、DNA連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊0.7%（0.28g/40ml)第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日（四）加樣及電泳檢測1、酶切樣品的檢測酶切陰性對照（M1）：pUC19標(biāo)樣20μl+6X的loadingbuffer4μl酶切樣品：pUC19酶切樣品20μl+6X的loadingbuffer3μl(1)第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日

DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶有兩種：來自大腸桿菌的DNA連接酶和來自噬菌體的T4DNA連接酶。二者的作用機(jī)理類似。實驗原理–

連接第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。DNA連接酶催化雙鏈DNA分子中相鄰堿基的5’-PO4末端與3’-OH間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。一個DNA片段的5’-PO4末端與另一個3’-OH末端相互靠近時，在DNA連接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的緩沖系統(tǒng)中可以被連接起來而形成重組分子。DNA連接酶作用機(jī)制實驗原理–

連接酶焦磷酸根酶-焦磷酸根酶第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日T4DNA連接酶作用機(jī)制：T4DNA連接酶作用分三步：(1)T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶－AMP復(fù)合物。(2)酶－AMP復(fù)合物結(jié)合到具有5’－磷酸基和3’－羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。(3)產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日常用的DNA連接酶是T4DNA連接酶，其作用底物是雙鏈的DNA分子或RNA：DNA雜交分子，可以連接粘性末端、平末端。T4DNA連接酶的活性用Weiss單位表示。1Weiss單位是指在37℃下20min內(nèi)催化1nmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需的酶量。第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日T4DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為３７℃，為什么實驗中采用１２～14℃？1.粘性末端形成的氫鍵在低溫下更穩(wěn)定；2.連接反應(yīng)時間長，低溫下酶不容易失活第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日材料、試劑及器具1、材料與試劑連接反應(yīng)：λDNA/EcoT14I:由11條DNA片段組成：19329、7743、6223bp、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74bpT4DNA連接酶及其配套的10×連接緩沖液檢測：0.5×TBE電泳緩沖液6×電泳載樣緩沖液、Goldview、瓊脂糖第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日2、器具：水平式電泳裝置電泳儀,臺式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋（用PCR儀代理）微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相機(jī)及其附件第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日（一）DNA片段的連接(注：每人一管）取200μl的離心管按下表加入試劑?！靹蚝簏c動離心，將溶液甩至管底↓置于已調(diào)好溫度為12℃-14℃PCR儀中↓保溫1-2h后取出↓電泳檢測樣品代號成分用量（μl）ddH2O7.0IλDNA/EcoT14I片段10.0f連接緩沖液2.0TT4DNA連接酶1.0總體積20實驗步驟第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日（二）DNA連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊1.2%瓊脂糖凝膠（0.48g/40ml）。第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日（三）加樣及電泳檢測連接樣品檢測：λ/EcoT14I樣品5μl（M2）DNA連接樣品：20μl恒壓電泳:130V電泳至溴酚藍(lán)離凝膠外端1-2cm處，大約30-40分鐘觀察:紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果，并拍照記錄。第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日實驗預(yù)期結(jié)果第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果從左至右：1.λ/EcoT14IDNAMarker2.pUC19質(zhì)粒3.pUC19質(zhì)粒酶切樣品123質(zhì)粒不同構(gòu)型的電泳行為線型DNA超螺旋DNA第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日1234561：λ-EcoT14digest2,3：連接產(chǎn)物4：pUC19質(zhì)粒5,6：酶切產(chǎn)物第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日酶切反應(yīng)注意事項

酶量，反應(yīng)時間及體積

Oneunitofenzymeisdefinedasthequantityneededtocut1μgofDNAin50ulinonehour

反應(yīng)時間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了,如果酶減少，可延長反應(yīng)時間（16h)；反應(yīng)體系不應(yīng)太小,常規(guī)的酶切一般要維持在10-50ul。

酶的體積不要超過總體積的10%（甘油應(yīng)在5%以下）。酶的使用：酶應(yīng)永遠(yuǎn)放冰上，應(yīng)是最后一個被加入到反應(yīng)體系中，用完后及時放回冰箱

DNA的制備：待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA,去污劑或過多鹽離子等

緩沖液：不同酶需不同離子強(qiáng)度緩沖液，使用前應(yīng)將緩沖液完全溶解并充分混勻。

混勻：很重要，注意不可振蕩反應(yīng)溫度：通常37℃終止反應(yīng)：終止液，熱失活，酚/氯仿抽提星號活性：在非理想條件下，內(nèi)切酶切割與識別位點相似但不完全相同的序列。第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日如果遇到酶切不動或切不完全，該怎么辦？

酶是否有活性2)模板性質(zhì)是否清楚：酶切效果與DNA的性質(zhì)（線狀，超螺旋狀）、位點數(shù)目、位點左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對超螺旋狀DNA完全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍3)

模板純度是否夠4)

甲基化程度對酶的活性是否有影響5)

反應(yīng)條件是否合適：溫度，BSA,緩沖溶液，DTT6)酶稀釋和添加方式是否正確：一般要求在最后加酶，提前混合，動作要快一些，沒有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用第四十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日其它結(jié)果限制酶