微生物學：17病毒感染的實驗診斷

病毒感染的實驗診斷

病毒性疾病實驗診斷的一般原則：特異、敏感、快速和簡便。首先根據(jù)流行病學和臨床特點，初步判斷可能感染的病毒；然后根據(jù)可疑病毒生物學特點、機體免疫應答和臨床過程，以及病人當前所處的時機，確定實驗診斷的方法。目前病毒感染的檢查主要依靠經(jīng)典的方法和近來發(fā)展起來的分子生物學等方法。

病毒學檢驗病毒分離培養(yǎng)病原學診斷形態(tài)學檢測分子生物學技術——病毒核酸補體結合試驗中和試驗血清學診斷血凝抑制試驗間接免疫熒光檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗

一、標本采集與運送（一）標本的采集

要從臨床標本中成功地分離出病毒，很大程度上取決于標本的恰當采樣和處理，為了保證標本質量，應注意以下問題：

1．采樣時間

盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者入院的當天進行，越早越好，最好在治療之前。疾病后期體內產(chǎn)生免疫力，病毒量減少或消失。

2．標本種類的選擇

根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學資料，判斷可能感染病毒的種類，選擇相應部位采取標本，處理標本時要考慮病毒的生物學特性。常見分離病毒標本的選擇見教材。

（1）

心臟疾病

（2）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

（3）

先天或新生兒感染

（4）

胃腸道疾病

（5）

呼吸道感染3.采集的基本注意事項1．合適的位置，避免附近的組織或分泌物的污染。2．最佳時間采集，血液標本應采集急性期和恢復期雙份血清測定抗體滴度。3．采集量要充分。4．使用合適的采集工具。消毒的、防漏的標本容器。5．盡可能在使用抗病毒藥物之前采集標本。6．恰當標記標本并填寫檢測申請單。寫明標本來源。7．盡量縮短運輸時間。8．注意防護

4．常見標本的采集方法

（1）血液：以無菌手續(xù)抽取抗凝血10ml，翻轉幾次?？鼓齽┛蛇x用100u/ml肝素鈉或EDTA。為了血清學檢查的需要，應抽取另一管5ml血液，不抗凝送檢。

（2）腦脊液：以無菌手續(xù)抽取腦脊液1~2ml，置無菌試管內，在冰浴中立即送檢。4℃可存放72h。eg?？滤_奇病毒，?？刹《?，腸道病毒，腮腺炎病毒。

（3）宮頸或陰道拭子采取病灶部位分泌物，將拭子置運送液中；如無病損部位，則清理宮頸口粘液，將拭子伸入宮頸約1cm停留5秒以上（順時針旋轉三圈）取出，置運送液中4℃冰浴立即送檢。eg.HPV,CMV

（4）糞便標本取2~4g糞便標本在無菌的容器中，加8~10ml運送液立即送檢。eg.腺病毒，腸道病毒，輪狀病毒。（5）含漱液可用無菌生理鹽水，讓患者含漱幾次取得，與運送液等量混合。eg.流感病毒，副流感病毒，鼻病毒，RSV（呼吸道合胞病毒）

（6）咽拭子：用生理鹽水濕潤的拭子采取咽喉部表面，置運送液中，注意避免唾液污染。eg.腺病毒，CMV，腸道病毒，HSV，流感病毒。（7）尿道拭子及尿液標本：尿道拭子伸入尿道4cm輕輕轉動2~3次，以獲得較多的上皮細胞，取出后置運送液中。eg.CMV，HSV（8）尸檢標本：應在死亡后盡早采取，采集各種器官時要分開使用器械和容器。已用福爾馬林或石蠟包埋的組織塊，可以用做免疫組化，核酸雜交，PCR。

（二）標本的運送和保存

標本采集后注意無菌、冷凍、保濕、立即送檢。分離培養(yǎng)病毒的標本要盡快送到實驗室處理和接種。如不能及時送檢，可在4℃冷藏數(shù)小時，如需較長時間保存則應置-70℃。放置在-20℃，病毒容易滅活，凍存液中需加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）等作保護，避免反復凍融使病毒滅活。

為了抑制細菌生長通常在病毒傳送培養(yǎng)基（VTMEagle's液或Hanks液中加入小牛血清或牛血清白蛋白）中加入抗生素如青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml，為了抑制真菌的生長加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。

二、病毒的分離與鑒定（金標準）（一）病毒分離和鑒定的一般程序

見書P327圖23-3（二）病毒的分離病毒是專性細胞寄生，需要在活細胞或動物體內才能得到分離。選擇何種動物或細胞來分離，應根據(jù)臨床感染的癥狀和流行病學資料，推測可能的病毒種類，選擇相對敏感的動物和細胞來分離標本中的病毒。細胞培養(yǎng)，雞胚接種，動物接種

1.細胞培養(yǎng)（1）

概念

將人或動物離體的活組織或分散的活細胞，在實驗室的試管或培養(yǎng)基中，模擬體內的生理條件使之生存和生長，稱之為組織培養(yǎng)。（2）

類型

A器官培養(yǎng)：如氣管、腸段。器官保存了原功能，用于分離某些有器官特異性的病毒。

B組織塊培養(yǎng)：如肝組織塊培養(yǎng)肝炎病毒。

C細胞培養(yǎng)（單層細胞培養(yǎng)）：現(xiàn)廣泛使用的組織培養(yǎng)技術。（3D培養(yǎng)）

（3）細胞培養(yǎng)的種類和方法

根據(jù)細胞的來源、染色體特性和傳代次數(shù)的不同可分為三類：

a.原代和次代細胞培養(yǎng)

離體的新鮮組織或器官，機械處理

胰蛋白

洗滌

吹打酶消化

加入營養(yǎng)液單個細胞懸液

1-3次

細胞計數(shù)

、調整細胞濃度

分裝在培養(yǎng)

生長

瓶內培養(yǎng)形成單層細胞，稱為原代細胞培養(yǎng)。

胰酶，EDTA轉種新的培養(yǎng)瓶形成單層細胞，稱為次代細胞培養(yǎng)

Eg.人胚腎或猴腎細胞。敏感性高但來源困難。

b．

二倍體細胞株

原代細胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（即含23對染色體），稱之為二倍體細胞。傳代細胞壽命一般為40~50代，可在培養(yǎng)早期進行冰凍保存，減少傳代次數(shù)，延長使用時間。大多數(shù)為人成纖維細胞,如人胚肺細胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。c．傳代細胞系

來源于腫瘤細胞或細胞株傳代過程的變異細胞。細胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。

Eg：Hela細胞，Hep-2，Vero細胞。（4）細胞培養(yǎng)的特點

優(yōu)點：A．來源廣；B．不受機體免疫因素影響，個體差異小，敏感范圍廣；C．易于觀察病變；D．可用于病毒的分離、鑒定、疫苗的制備；E．易管理，相對比較經(jīng)濟。

缺點：條件要求高，必須要有細胞培養(yǎng)的條件。

2.雞胚接種

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

（1）

常用接種部位和用途

38-39℃

新鮮受精卵

5-13天

卵黃囊接種（乙腦）羊膜腔接種（流感腮腺炎）尿囊腔接種（同上）絨毛尿囊膜（皰疹，痘類）卵殼氣室尿囊絨毛尿囊膜卵黃囊卵白羊膜羊水囊

①

卵黃囊接種：流行性乙型腦炎病毒分離②羊水腔接種：流感病毒、副流感病毒的初次分離③尿囊腔接種：流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒分離④絨毛尿囊膜接種：痘病毒、皰疹病毒分離（痘瘡）

（2）

雞胚接種的特點

優(yōu)點：A.雞胚是一個整體，可有多種接種途徑；B.可收獲大量病毒；C.雞胚本是無菌無病毒的，對接種病毒不產(chǎn)生抗體；D.來源廣，操作簡便。

缺點:

A.易感病毒較少，應用較局限；B.反復用雞胚傳代，病毒毒力可下降。

C.胚內可能污染細菌和病毒,母體抗體

3.動物接種

（1）

常用動物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等

（2）

接種途徑：

呼吸道病毒：如流感病毒，滴鼻接種3周齡新生小鼠

腸道病毒：如柯薩奇病毒，腹腔接種乳鼠（一日齡）

乙肝病毒：靜脈注射猩猩

嗜神經(jīng)病毒：如乙腦病毒（用3周齡小鼠）、狂犬病毒（用家兔），顱內接種

（3）

接種后觀察：

應每日至少兩次，必要時每隔2~4小時觀察一次。根據(jù)實驗目的不同，觀察不同的反應情況。

小鼠：食欲減退，活動遲緩，聳毛，震顫，麻痹，癱瘓，死亡。

（4）

動物接種特點

優(yōu)點：A.可以按照不同途徑分離鑒定病毒，可模擬人類感染途徑

B.可用于疫苗的篩選、制備

C.可用于制備抗血清

D.操作簡便，對環(huán)境要求低

缺點：A.可自然帶毒或隱性感染，影響結果觀察

B.存在個體差異

C.敏感病毒較少，或有些病毒感染后不出現(xiàn)明顯癥狀，不宜觀察

D.不經(jīng)濟，難管理

（三）病毒的鑒定

1.初步鑒定

根據(jù)臨床癥狀、流行病學特點、標本來源、易感動物范圍、細胞病變特征及生物學特性、理化性質，可初步確定病毒屬于何科何屬。

（1）

動物感染范圍及潛伏期

病毒感染動物的范圍、發(fā)病的潛伏期有差異。如柯薩奇B組病毒對新生乳鼠致病，對成年小鼠不致?。恍∈竽X內接種乙腦病毒，潛伏期一般為4天，少于4天發(fā)病則可能為非乙腦病毒引起。

（2）對雞胚的敏感性

不同病毒對雞胚不同接種途徑敏感性不同。

直接法：如觀察絨毛尿囊膜是否有病灶

間接法：尿囊液、羊水做血凝抑制試驗等

（3）

病毒在細胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)

①

細胞代謝類型改變：細胞代謝產(chǎn)酸可導致培養(yǎng)液pH指示劑呈黃色，病毒增殖抑制了細胞代謝，使培養(yǎng)液不變色或變紅。但腺病毒不抑制細胞代謝，反而促進糖酵解增加產(chǎn)酸。

②細胞形態(tài)學變化

由病毒增殖所引起的細胞變化稱為細胞病變效應(cytopathiceffectCPE)。

A.細胞溶解，細胞培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)空斑,如腸道病毒；

B.細胞融合形成多核巨細胞，如皰疹病毒；

C.細胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，如腺病毒；

D.胞漿內或核內出現(xiàn)嗜酸性包涵體，如狂犬病毒：

E.不出現(xiàn)細胞病變現(xiàn)象。

③空斑或蝕斑（plaque）形成試驗空斑是指在單層細胞中被病毒感染引起死亡的細胞區(qū)域，周圍被活細胞包圍。一般而言，一個空斑是由一個感染性病毒顆粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同。可進行病毒顆粒的計數(shù)、純化，結合中和試驗可進行病毒的鑒定。

④干擾現(xiàn)象（Interference）一種病毒感染細胞后，可以干擾以后進入的病毒的增殖。利用此現(xiàn)象鑒定不引起形態(tài)學變化的病毒。如某些型別的鼻病毒能干擾以后進入的副流感Ⅰ型病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細胞吸附作用。

同種以及同株的病毒間，如流感病毒的自身干擾。異種病毒和無親緣關系的病毒之間也可以干擾，且比較常見。1.誘導產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN）2.破壞了宿主細胞的表面受體或者改變了宿主細胞的代謝途徑3.阻止第二種mRNA的轉譯

⑤紅細胞吸附（HAd）及吸附抑制試驗紅細胞吸附現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于病毒在細胞膜成熟時，將其血凝素插入細胞膜，使感染細胞吸附紅細胞，是病毒增殖的指標。該現(xiàn)象可被相應的病毒特異性抗體所抑制，稱為紅細胞吸附抑制試驗，可用來鑒定病毒。

（4）

理化性質的測定

①病毒的大小和形態(tài)：可用電鏡觀察病毒的大小和形態(tài)。②核酸類型鑒別及序列測定：利用5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）抑制DNA復制的特性，在細胞培養(yǎng)液中加入該物質，可抑制DNA病毒的復制和增殖，抑制細胞病變的出現(xiàn)，但對RNA病毒無抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。也可對病毒特異序列或全序列的堿基排列測定或DNA雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。

③耐酸試驗

腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。

④乙醚敏感試驗

病毒外周如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進行試驗。

2.最后鑒定——血清學試驗

在初步鑒定的基礎上，對已分離出陽性結果需選擇適當?shù)难鍖W方法對病毒分離株作最后鑒定。血清學方法鑒定是將分離到的病毒和已知病毒的參考血清作中和試驗、補體結合試驗、血凝抑制試驗等。由于分子病毒學的發(fā)展，病毒的最后鑒定還應包括分子生物學方法的鑒定，它還能檢出不產(chǎn)生細胞病變的那些病毒。

（1）中和試驗是將病毒與特異性抗體進行免疫反應，使病毒失去感染性，在細胞培養(yǎng)和活的機體內不出現(xiàn)病變的試驗。常用細胞培養(yǎng)進行中和試驗。方法：①固定病毒（100TCID50），稀釋血清，測Ab效價。兩次效價相差4倍以上有診斷意義。TCID50：50%組織細胞感染的病毒劑量(50%Tissuecellinfectivedose

TCID50)。②固定血清（1：20或1：40），稀釋病毒，求中和指數(shù)。固定病毒本法用以測定抗病毒血清的中和價，將待檢血清2倍遞增稀釋，加等量已知毒價的病毒液（與血清混合后，每一接種劑量含病毒100LD50），搖勻后，置37℃作用1h，接種實驗動物固定血清本法多將病毒作10倍遞增稀釋，分置2列試管，第一列加正常血清（對照組），第二列加待檢血清（試驗組）。混合后，置37℃作用1h，將各管混合液分別接種選定的試驗動物，每一稀釋度用3～5只動物。接種后，逐日觀察，并記錄其死亡數(shù)，觀察結束后，計算LD50和中和指數(shù)?？瞻邷p少法在細胞培養(yǎng)上進行病毒中和試驗，近年來多采用空斑減少法。先將病毒稀釋成適當濃度，使每0.2ml含80個～100個PFU（空斑形成單位），與不同稀釋度的待檢血清等量混合，置37℃作用1h～2h，分別測定PFU，使空斑減少50％血清稀釋度即為該血清的中和價

中和指數(shù)>50為陽性，有意義；中和指數(shù)<9為陰性，無意義；中和指數(shù)10~49，為可凝。

中和指數(shù)：實驗組/對照組比值中和試驗較復雜和費時，多用于V的鑒定和流行病學調查，對臨床診斷價值不大。（2）血凝與血凝抑制試驗某些病毒可與一定種類的哺乳動物或禽類的紅細胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，稱為血凝抑制試驗。可作為病毒型別鑒定的依據(jù)。（3）補體結合試驗

三、病毒感染的快速診斷（一）、病毒的形態(tài)學檢查

1.

光學顯微鏡

可以觀察到大型的病毒如痘病毒類。在光學顯微鏡下還可以觀察到病毒感染的宿主細胞的胞質內或細胞核內出現(xiàn)嗜酸性的包涵體（inclusionbody）。根據(jù)包涵體的特點，可以作出輔助診斷。包涵體可能是病毒增殖的場所或病毒顆粒的聚合體，也可能是宿主細胞對病毒作用的反應產(chǎn)物，一般來說，產(chǎn)生核內包涵體的是在細胞核內裝配的病毒（通常為DNA病毒），產(chǎn)生胞質內包涵體的是在胞質中裝配病毒（通常為RNA病毒）。

2.

電子顯微鏡檢查（1）電鏡直接檢查：某些病毒感染的早期在臨床標本中就可出現(xiàn)病毒顆粒。經(jīng)粗提濃縮后用磷鎢酸鹽負染，電鏡下直接觀察，可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，獲得診斷。（2）免疫電鏡檢查：在含病毒的標本中，加入特異抗體。經(jīng)抗原抗體反應后，使標本中的病毒顆粒聚集成塊，再經(jīng)負染觀察，比直接電鏡檢查更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。（二）、病毒抗原檢查病毒抗原是病毒特異性的標志，通過免疫學技術檢測標本中的特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。用于病毒抗原檢查的抗體，最好是單克隆抗體。

1.

免疫熒光技術

有直接和間接熒光法。具有快速、實用的優(yōu)點。適合于病毒型別少，細胞培養(yǎng)難以成功的病毒。間接熒光技術具有放大作用，因而靈敏度比直接法高。免疫熒光技術易出現(xiàn)非特異性熒光，導致假陽性，需要嚴格對照和排除試驗。

2.

酶免疫技術有酶免組化和酶免吸附試驗法。酶免組化法與免疫熒光技術相同，不同的是將熒光標記改為酶標記。由于酶反應的產(chǎn)物具有累積性，因而靈敏度比熒光技術高。

3.其它技術

如固相放射免疫技術、發(fā)光免疫分析技術、膠體金標記的免疫層析技術等。

（三）抗體檢測檢測病毒感染機體后產(chǎn)生的早期特異性抗體。

1.

斑點雜交法(dotblothybridization)：

將待測的DNA或RNA直接點在雜交濾膜上,變性后,用標記的核酸探針進行雜交。

（四）、病毒核酸檢測

2.

固相雜交技術將核酸探針進行修飾后，包被強力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待測的核酸序列和標記的指示探針在微孔板的雜交液中，進行雜交，洗滌后，用酶免疫技術進行檢測?；驅⒑怂崽结槹挥谖⑿〈胖楸砻妫瑧腋∮陔s交液中。與待測的核酸序列及標記的指示探針進行雜交。用磁分離技術分離結合有雜交體的磁體，進行檢測。

3.原位分子雜交技術（insituhybridization），F(xiàn)ISH

是核酸雜交技術結合細胞學技術的一種特殊檢測技術。通過將細胞固定后，在不破壞細胞結構的前提下，在細胞原位釋放暴露DNA或RNA，加入標記的特異核酸探針，進行雜交。通過顯色技術，可以顯示特定的雜交探針在細胞內的位置和核酸的數(shù)量。直接觀察待測核酸在細胞內的分布狀態(tài)與細胞染色體的關系。

4.Southern印跡法和Northern印跡法：

Southern印跡法用于DNA的雜交。將DNA提取后，直接或經(jīng)限制性內切酶切割后，在瓊脂糖電泳中使DNA按分子量大小分開，然后將瓊脂糖凝膠中的DNA移至硝酸纖維膜上，用標記探針進行雜交?？梢詸z測病毒DNA中的特異序列。

Northern印跡法用于RNA的雜交分析。利用RNA與DBM(diagobenloxymethyl)結合的特點，將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標記探針進行雜交。RNA也可轉移至硝酸纖維膜上進行雜交分析。用于檢測RNA或mRNA。

5.聚合酶鏈反應(polymerasechainreactionPCR)：選擇病毒的特異、保守片段作為靶基因，進行引物設計和擴增，可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結合RFLP，測序等技術可以對病毒進行分析和突變的研究。（1）

DNA病毒：可直接進行PCR擴增其特異片段。（2）

RNA病毒：可通過RT-PCR技術，將RNA逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增，常結合巢式PCR(nest-PCR)技術進行二次擴增，提高了反應的靈敏度和特異性。（3）

定量PCR技術：PCR技術是以指數(shù)方式對靶基因進行擴增。采用內標準對擴增的產(chǎn)物進行原始標本定量，對病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時，對研究病毒和機體之間的關系提供了參考。

6.

病毒核酸的直接檢測有些病毒如輪狀病毒的核酸具有典型的分節(jié)段特點?？梢詮臉吮局兄苯犹崛≥啝畈《镜暮怂?。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），觀察其特有的11個核酸