微生物學(xué)：17病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷

病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷

病毒性疾病實(shí)驗(yàn)診斷的一般原則：特異、敏感、快速和簡便。首先根據(jù)流行病學(xué)和臨床特點(diǎn)，初步判斷可能感染的病毒；然后根據(jù)可疑病毒生物學(xué)特點(diǎn)、機(jī)體免疫應(yīng)答和臨床過程，以及病人當(dāng)前所處的時(shí)機(jī)，確定實(shí)驗(yàn)診斷的方法。目前病毒感染的檢查主要依靠經(jīng)典的方法和近來發(fā)展起來的分子生物學(xué)等方法。

病毒學(xué)檢驗(yàn)病毒分離培養(yǎng)病原學(xué)診斷形態(tài)學(xué)檢測分子生物學(xué)技術(shù)——病毒核酸補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和試驗(yàn)血清學(xué)診斷血凝抑制試驗(yàn)間接免疫熒光檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

一、標(biāo)本采集與運(yùn)送（一）標(biāo)本的采集

要從臨床標(biāo)本中成功地分離出病毒，很大程度上取決于標(biāo)本的恰當(dāng)采樣和處理，為了保證標(biāo)本質(zhì)量，應(yīng)注意以下問題：

1．采樣時(shí)間

盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者入院的當(dāng)天進(jìn)行，越早越好，最好在治療之前。疾病后期體內(nèi)產(chǎn)生免疫力，病毒量減少或消失。

2．標(biāo)本種類的選擇

根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可能感染病毒的種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本，處理標(biāo)本時(shí)要考慮病毒的生物學(xué)特性。常見分離病毒標(biāo)本的選擇見教材。

（1）

心臟疾病

（2）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

（3）

先天或新生兒感染

（4）

胃腸道疾病

（5）

呼吸道感染3.采集的基本注意事項(xiàng)1．合適的位置，避免附近的組織或分泌物的污染。2．最佳時(shí)間采集，血液標(biāo)本應(yīng)采集急性期和恢復(fù)期雙份血清測定抗體滴度。3．采集量要充分。4．使用合適的采集工具。消毒的、防漏的標(biāo)本容器。5．盡可能在使用抗病毒藥物之前采集標(biāo)本。6．恰當(dāng)標(biāo)記標(biāo)本并填寫檢測申請單。寫明標(biāo)本來源。7．盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間。8．注意防護(hù)

4．常見標(biāo)本的采集方法

（1）血液：以無菌手續(xù)抽取抗凝血10ml，翻轉(zhuǎn)幾次。抗凝劑可選用100u/ml肝素鈉或EDTA。為了血清學(xué)檢查的需要，應(yīng)抽取另一管5ml血液，不抗凝送檢。

（2）腦脊液：以無菌手續(xù)抽取腦脊液1~2ml，置無菌試管內(nèi)，在冰浴中立即送檢。4℃可存放72h。eg。柯薩奇病毒，?？刹《?，腸道病毒，腮腺炎病毒。

（3）宮頸或陰道拭子采取病灶部位分泌物，將拭子置運(yùn)送液中；如無病損部位，則清理宮頸口粘液，將拭子伸入宮頸約1cm停留5秒以上（順時(shí)針旋轉(zhuǎn)三圈）取出，置運(yùn)送液中4℃冰浴立即送檢。eg.HPV,CMV

（4）糞便標(biāo)本取2~4g糞便標(biāo)本在無菌的容器中，加8~10ml運(yùn)送液立即送檢。eg.腺病毒，腸道病毒，輪狀病毒。（5）含漱液可用無菌生理鹽水，讓患者含漱幾次取得，與運(yùn)送液等量混合。eg.流感病毒，副流感病毒，鼻病毒，RSV（呼吸道合胞病毒）

（6）咽拭子：用生理鹽水濕潤的拭子采取咽喉部表面，置運(yùn)送液中，注意避免唾液污染。eg.腺病毒，CMV，腸道病毒，HSV，流感病毒。（7）尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸入尿道4cm輕輕轉(zhuǎn)動2~3次，以獲得較多的上皮細(xì)胞，取出后置運(yùn)送液中。eg.CMV，HSV（8）尸檢標(biāo)本：應(yīng)在死亡后盡早采取，采集各種器官時(shí)要分開使用器械和容器。已用福爾馬林或石蠟包埋的組織塊，可以用做免疫組化，核酸雜交，PCR。

（二）標(biāo)本的運(yùn)送和保存

標(biāo)本采集后注意無菌、冷凍、保濕、立即送檢。分離培養(yǎng)病毒的標(biāo)本要盡快送到實(shí)驗(yàn)室處理和接種。如不能及時(shí)送檢，可在4℃冷藏?cái)?shù)小時(shí)，如需較長時(shí)間保存則應(yīng)置-70℃。放置在-20℃，病毒容易滅活，凍存液中需加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）等作保護(hù)，避免反復(fù)凍融使病毒滅活。

為了抑制細(xì)菌生長通常在病毒傳送培養(yǎng)基（VTMEagle's液或Hanks液中加入小牛血清或牛血清白蛋白）中加入抗生素如青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml，為了抑制真菌的生長加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。

二、病毒的分離與鑒定（金標(biāo)準(zhǔn)）（一）病毒分離和鑒定的一般程序

見書P327圖23-3（二）病毒的分離病毒是專性細(xì)胞寄生，需要在活細(xì)胞或動物體內(nèi)才能得到分離。選擇何種動物或細(xì)胞來分離，應(yīng)根據(jù)臨床感染的癥狀和流行病學(xué)資料，推測可能的病毒種類，選擇相對敏感的動物和細(xì)胞來分離標(biāo)本中的病毒。細(xì)胞培養(yǎng)，雞胚接種，動物接種

1.細(xì)胞培養(yǎng)（1）

概念

將人或動物離體的活組織或分散的活細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室的試管或培養(yǎng)基中，模擬體內(nèi)的生理?xiàng)l件使之生存和生長，稱之為組織培養(yǎng)。（2）

類型

A器官培養(yǎng)：如氣管、腸段。器官保存了原功能，用于分離某些有器官特異性的病毒。

B組織塊培養(yǎng)：如肝組織塊培養(yǎng)肝炎病毒。

C細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）：現(xiàn)廣泛使用的組織培養(yǎng)技術(shù)。（3D培養(yǎng)）

（3）細(xì)胞培養(yǎng)的種類和方法

根據(jù)細(xì)胞的來源、染色體特性和傳代次數(shù)的不同可分為三類：

a.原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)

離體的新鮮組織或器官，機(jī)械處理

胰蛋白

洗滌

吹打酶消化

加入營養(yǎng)液單個(gè)細(xì)胞懸液

1-3次

細(xì)胞計(jì)數(shù)

、調(diào)整細(xì)胞濃度

分裝在培養(yǎng)

生長

瓶內(nèi)培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

胰酶，EDTA轉(zhuǎn)種新的培養(yǎng)瓶形成單層細(xì)胞，稱為次代細(xì)胞培養(yǎng)

Eg.人胚腎或猴腎細(xì)胞。敏感性高但來源困難。

b．

二倍體細(xì)胞株

原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（即含23對染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為40~50代，可在培養(yǎng)早期進(jìn)行冰凍保存，減少傳代次數(shù)，延長使用時(shí)間。大多數(shù)為人成纖維細(xì)胞,如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。c．傳代細(xì)胞系

來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。

Eg：Hela細(xì)胞，Hep-2，Vero細(xì)胞。（4）細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：A．來源廣；B．不受機(jī)體免疫因素影響，個(gè)體差異小，敏感范圍廣；C．易于觀察病變；D．可用于病毒的分離、鑒定、疫苗的制備；E．易管理，相對比較經(jīng)濟(jì)。

缺點(diǎn)：條件要求高，必須要有細(xì)胞培養(yǎng)的條件。

2.雞胚接種

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

（1）

常用接種部位和用途

38-39℃

新鮮受精卵

5-13天

卵黃囊接種（乙腦）羊膜腔接種（流感腮腺炎）尿囊腔接種（同上）絨毛尿囊膜（皰疹，痘類）卵殼氣室尿囊絨毛尿囊膜卵黃囊卵白羊膜羊水囊

①

卵黃囊接種：流行性乙型腦炎病毒分離②羊水腔接種：流感病毒、副流感病毒的初次分離③尿囊腔接種：流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒分離④絨毛尿囊膜接種：痘病毒、皰疹病毒分離（痘瘡）

（2）

雞胚接種的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：A.雞胚是一個(gè)整體，可有多種接種途徑；B.可收獲大量病毒；C.雞胚本是無菌無病毒的，對接種病毒不產(chǎn)生抗體；D.來源廣，操作簡便。

缺點(diǎn):

A.易感病毒較少，應(yīng)用較局限；B.反復(fù)用雞胚傳代，病毒毒力可下降。

C.胚內(nèi)可能污染細(xì)菌和病毒,母體抗體

3.動物接種

（1）

常用動物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等

（2）

接種途徑：

呼吸道病毒：如流感病毒，滴鼻接種3周齡新生小鼠

腸道病毒：如柯薩奇病毒，腹腔接種乳鼠（一日齡）

乙肝病毒：靜脈注射猩猩

嗜神經(jīng)病毒：如乙腦病毒（用3周齡小鼠）、狂犬病毒（用家兔），顱內(nèi)接種

（3）

接種后觀察：

應(yīng)每日至少兩次，必要時(shí)每隔2~4小時(shí)觀察一次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，觀察不同的反應(yīng)情況。

小鼠：食欲減退，活動遲緩，聳毛，震顫，麻痹，癱瘓，死亡。

（4）

動物接種特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：A.可以按照不同途徑分離鑒定病毒，可模擬人類感染途徑

B.可用于疫苗的篩選、制備

C.可用于制備抗血清

D.操作簡便，對環(huán)境要求低

缺點(diǎn)：A.可自然帶毒或隱性感染，影響結(jié)果觀察

B.存在個(gè)體差異

C.敏感病毒較少，或有些病毒感染后不出現(xiàn)明顯癥狀，不宜觀察

D.不經(jīng)濟(jì)，難管理

（三）病毒的鑒定

1.初步鑒定

根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)、標(biāo)本來源、易感動物范圍、細(xì)胞病變特征及生物學(xué)特性、理化性質(zhì)，可初步確定病毒屬于何科何屬。

（1）

動物感染范圍及潛伏期

病毒感染動物的范圍、發(fā)病的潛伏期有差異。如柯薩奇B組病毒對新生乳鼠致病，對成年小鼠不致病；小鼠腦內(nèi)接種乙腦病毒，潛伏期一般為4天，少于4天發(fā)病則可能為非乙腦病毒引起。

（2）對雞胚的敏感性

不同病毒對雞胚不同接種途徑敏感性不同。

直接法：如觀察絨毛尿囊膜是否有病灶

間接法：尿囊液、羊水做血凝抑制試驗(yàn)等

（3）

病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)

①

細(xì)胞代謝類型改變：細(xì)胞代謝產(chǎn)酸可導(dǎo)致培養(yǎng)液pH指示劑呈黃色，病毒增殖抑制了細(xì)胞代謝，使培養(yǎng)液不變色或變紅。但腺病毒不抑制細(xì)胞代謝，反而促進(jìn)糖酵解增加產(chǎn)酸。

②細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

由病毒增殖所引起的細(xì)胞變化稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffectCPE)。

A.細(xì)胞溶解，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)空斑,如腸道病毒；

B.細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，如皰疹病毒；

C.細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，如腺病毒；

D.胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，如狂犬病毒：

E.不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。

③空斑或蝕斑（plaque）形成試驗(yàn)空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M(jìn)行病毒顆粒的計(jì)數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗(yàn)可進(jìn)行病毒的鑒定。

④干擾現(xiàn)象（Interference）一種病毒感染細(xì)胞后，可以干擾以后進(jìn)入的病毒的增殖。利用此現(xiàn)象鑒定不引起形態(tài)學(xué)變化的病毒。如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感Ⅰ型病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。

同種以及同株的病毒間，如流感病毒的自身干擾。異種病毒和無親緣關(guān)系的病毒之間也可以干擾，且比較常見。1.誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN）2.破壞了宿主細(xì)胞的表面受體或者改變了宿主細(xì)胞的代謝途徑3.阻止第二種mRNA的轉(zhuǎn)譯

⑤紅細(xì)胞吸附（HAd）及吸附抑制試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于病毒在細(xì)胞膜成熟時(shí)，將其血凝素插入細(xì)胞膜，使感染細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，是病毒增殖的指標(biāo)。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的病毒特異性抗體所抑制，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)，可用來鑒定病毒。

（4）

理化性質(zhì)的測定

①病毒的大小和形態(tài)：可用電鏡觀察病毒的大小和形態(tài)。②核酸類型鑒別及序列測定：利用5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）抑制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對RNA病毒無抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。也可對病毒特異序列或全序列的堿基排列測定或DNA雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。

③耐酸試驗(yàn)

腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。

④乙醚敏感試驗(yàn)

病毒外周如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。

2.最后鑒定——血清學(xué)試驗(yàn)

在初步鑒定的基礎(chǔ)上，對已分離出陽性結(jié)果需選擇適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)方法對病毒分離株作最后鑒定。血清學(xué)方法鑒定是將分離到的病毒和已知病毒的參考血清作中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等。由于分子病毒學(xué)的發(fā)展，病毒的最后鑒定還應(yīng)包括分子生物學(xué)方法的鑒定，它還能檢出不產(chǎn)生細(xì)胞病變的那些病毒。

（1）中和試驗(yàn)是將病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗(yàn)。常用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行中和試驗(yàn)。方法：①固定病毒（100TCID50），稀釋血清，測Ab效價(jià)。兩次效價(jià)相差4倍以上有診斷意義。TCID50：50%組織細(xì)胞感染的病毒劑量(50%Tissuecellinfectivedose

TCID50)。②固定血清（1：20或1：40），稀釋病毒，求中和指數(shù)。固定病毒本法用以測定抗病毒血清的中和價(jià)，將待檢血清2倍遞增稀釋，加等量已知毒價(jià)的病毒液（與血清混合后，每一接種劑量含病毒100LD50），搖勻后，置37℃作用1h，接種實(shí)驗(yàn)動物固定血清本法多將病毒作10倍遞增稀釋，分置2列試管，第一列加正常血清（對照組），第二列加待檢血清（試驗(yàn)組）?；旌虾?，置37℃作用1h，將各管混合液分別接種選定的試驗(yàn)動物，每一稀釋度用3～5只動物。接種后，逐日觀察，并記錄其死亡數(shù)，觀察結(jié)束后，計(jì)算LD50和中和指數(shù)?？瞻邷p少法在細(xì)胞培養(yǎng)上進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，近年來多采用空斑減少法。先將病毒稀釋成適當(dāng)濃度，使每0.2ml含80個(gè)～100個(gè)PFU（空斑形成單位），與不同稀釋度的待檢血清等量混合，置37℃作用1h～2h，分別測定PFU，使空斑減少50％血清稀釋度即為該血清的中和價(jià)

中和指數(shù)>50為陽性，有意義；中和指數(shù)<9為陰性，無意義；中和指數(shù)10~49，為可凝。

中和指數(shù)：實(shí)驗(yàn)組/對照組比值中和試驗(yàn)較復(fù)雜和費(fèi)時(shí)，多用于V的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，對臨床診斷價(jià)值不大。（2）血凝與血凝抑制試驗(yàn)?zāi)承┎《究膳c一定種類的哺乳動物或禽類的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，稱為血凝抑制試驗(yàn)?？勺鳛椴《拘蛣e鑒定的依據(jù)。（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

三、病毒感染的快速診斷（一）、病毒的形態(tài)學(xué)檢查

1.

光學(xué)顯微鏡

可以觀察到大型的病毒如痘病毒類。在光學(xué)顯微鏡下還可以觀察到病毒感染的宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性的包涵體（inclusionbody）。根據(jù)包涵體的特點(diǎn)，可以作出輔助診斷。包涵體可能是病毒增殖的場所或病毒顆粒的聚合體，也可能是宿主細(xì)胞對病毒作用的反應(yīng)產(chǎn)物，一般來說，產(chǎn)生核內(nèi)包涵體的是在細(xì)胞核內(nèi)裝配的病毒（通常為DNA病毒），產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)包涵體的是在胞質(zhì)中裝配病毒（通常為RNA病毒）。

2.

電子顯微鏡檢查（1）電鏡直接檢查：某些病毒感染的早期在臨床標(biāo)本中就可出現(xiàn)病毒顆粒。經(jīng)粗提濃縮后用磷鎢酸鹽負(fù)染，電鏡下直接觀察，可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，獲得診斷。（2）免疫電鏡檢查：在含病毒的標(biāo)本中，加入特異抗體。經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，使標(biāo)本中的病毒顆粒聚集成塊，再經(jīng)負(fù)染觀察，比直接電鏡檢查更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。（二）、病毒抗原檢查病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過免疫學(xué)技術(shù)檢測標(biāo)本中的特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。用于病毒抗原檢查的抗體，最好是單克隆抗體。

1.

免疫熒光技術(shù)

有直接和間接熒光法。具有快速、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。適合于病毒型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒。間接熒光技術(shù)具有放大作用，因而靈敏度比直接法高。免疫熒光技術(shù)易出現(xiàn)非特異性熒光，導(dǎo)致假陽性，需要嚴(yán)格對照和排除試驗(yàn)。

2.

酶免疫技術(shù)有酶免組化和酶免吸附試驗(yàn)法。酶免組化法與免疫熒光技術(shù)相同，不同的是將熒光標(biāo)記改為酶標(biāo)記。由于酶反應(yīng)的產(chǎn)物具有累積性，因而靈敏度比熒光技術(shù)高。

3.其它技術(shù)

如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。

（三）抗體檢測檢測病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體。

1.

斑點(diǎn)雜交法(dotblothybridization)：

將待測的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上,變性后,用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。

（四）、病毒核酸檢測

2.

固相雜交技術(shù)將核酸探針進(jìn)行修飾后，包被強(qiáng)力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待測的核酸序列和標(biāo)記的指示探針在微孔板的雜交液中，進(jìn)行雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測?；?qū)⒑怂崽结槹挥谖⑿〈胖楸砻?，懸浮于雜交液中。與待測的核酸序列及標(biāo)記的指示探針進(jìn)行雜交。用磁分離技術(shù)分離結(jié)合有雜交體的磁體，進(jìn)行檢測。

3.原位分子雜交技術(shù)（insituhybridization），F(xiàn)ISH

是核酸雜交技術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)技術(shù)的一種特殊檢測技術(shù)。通過將細(xì)胞固定后，在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下，在細(xì)胞原位釋放暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記的特異核酸探針，進(jìn)行雜交。通過顯色技術(shù)，可以顯示特定的雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。直接觀察待測核酸在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)與細(xì)胞染色體的關(guān)系。

4.Southern印跡法和Northern印跡法：

Southern印跡法用于DNA的雜交。將DNA提取后，直接或經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，在瓊脂糖電泳中使DNA按分子量大小分開，然后將瓊脂糖凝膠中的DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交?？梢詸z測病毒DNA中的特異序列。

Northern印跡法用于RNA的雜交分析。利用RNA與DBM(diagobenloxymethyl)結(jié)合的特點(diǎn)，將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。RNA也可轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進(jìn)行雜交分析。用于檢測RNA或mRNA。

5.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionPCR)：選擇病毒的特異、保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增，可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結(jié)合RFLP，測序等技術(shù)可以對病毒進(jìn)行分析和突變的研究。（1）

DNA病毒：可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增其特異片段。（2）

RNA病毒：可通過RT-PCR技術(shù)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，常結(jié)合巢式PCR(nest-PCR)技術(shù)進(jìn)行二次擴(kuò)增，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。（3）

定量PCR技術(shù)：PCR技術(shù)是以指數(shù)方式對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行原始標(biāo)本定量，對病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時(shí)，對研究病毒和機(jī)體之間的關(guān)系提供了參考。

6.

病毒核酸的直接檢測有些病毒如輪狀病毒的核酸具有典型的分節(jié)段特點(diǎn)?？梢詮臉?biāo)本中直接提取輪狀病毒的核酸。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），觀察其特有的11個(gè)核酸